2. Алгоритм дифференциации генетических вариантов вируса SARS-CoV-2 с помощью фрагментного секвенирования полной последовательности гена, кодирующего S-белок

2. Алгоритм дифференциации генетических вариантов вируса SARS-CoV-2 с помощью фрагментного секвенирования полной последовательности гена, кодирующего S-белок.

Для дифференциации генетических вариантов вируса SARS-CoV-2 с помощью фрагментного секвенирования полной последовательности гена, кодирующего S-белок, предлагается использовать тот же алгоритм, что и указанный выше для фрагментного секвенирования отдельных локусов.

Для амплификации полного гена S, необходимого для определения геновариантов вируса SARS-CoV-2, используют олигонуклеотидные праймеры из протокола ARTIC v3, перекрывающие полную нуклеотидную последовательность гена S SARS-CoV-2 длиной 3822 нуклеотидных оснований (позиция в геноме 21562 - 25384 н.о.).

Их последовательности и позиции в геноме, а также длина ожидаемых ампликонов, указаны ниже (см. таблица 8). Рекомендуемые условия проведения реакции амплификации при использовании протокола ARTIC v.3 приведены в таблице 8.

Таблица 8. Нуклеотидные последовательности и позиции в геноме олигонуклеотидных праймеров для секвенирования гена S SARS-CoV-2 (протокол ARTIC v3).

--------------------------------

<*> ВНИМАНИЕ! Структура праймера N 1 (nCoV-2019_72_LEFT_alt) является уникальной, не входит в набор оригинального протокола ARTIC v3 и требует отдельного заказа.

	name	Позиция	seq	length	%gc	Длина ампликона
1	nCoV-2019_72_LEFT_alt	21508 - 21544	FGAGTTGTTATTTCTAGTGATGTTCTTG	27	33.00	530
2	nCoV-2019_72_RIGHT	22014 - 22038	ACTCTGAACTCACTTTCCATCCAAC	25	44.00	530
3	nCoV-2019_73_LEFT	21962 - 21990	CAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGT	29	31.03	384
4	nCoV-2019_73_RIGHT	22327 - 22346	CACCAGCTGTCCAACCTGAAGA	22	54.55	384
5	nCoV-2019_74_LEFT	22263 - 22290	ACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGC	28	35.71	387
6	nCoV-2019_74_RIGHT	22627 - 22650	GCAACACAGTTGCTGATTCTCTTC	24	45.83	387
7	nCoV-2019_75_LEFT	22517 - 22542	AGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGT	26	38.46	386
8	nCoV-2019_75_RIGHT	22878 - 22903	ACCACCAACCTTAGAATCAAGATTGT	26	38.46	386
9	nCoV-2019_76_LEFT_alt3	22799 - 22821	GGGCAAACTGGAAAGATTGCTGA	23	47.83	413
10	nCoV-2019_76_RIGHT_alt0	23190 - 23212	ACCTGTGCCTGTTAAACCATTGA	23	43.48	413
11	nCoV-2019_77_LEFT	23123 - 23144	CCAGCAACTGTTTGTGGACCTA	22	50.00	399
12	nCoV-2019_77_RIGHT	23501 - 23522	CAGCCCCTATTAAACAGCCTGC	22	54.55	399
13	nCoV-2019_78_LEFT	23444 - 23466	CAACTTACTCCTACTTGGCGTGT	23	47.83	403
14	nCoV-2019_78_RIGHT	23823 - 23847	TGTGTACAAAAACTGCCATATTGCA	25	36.00	403
15	nCoV-2019_79_LEFT	23790 - 23812	GTGGTGATTCAACTGAATGCAGC	23	47.83	379
16	nCoV-2019_79_RIGHT	24146 - 24169	CATTTCATCTGTGAGCAAAGGTGG	24	45.83	379
17	nCoV-2019_80_LEFT	24079 - 24100	TTGCCTTGGTGATATTGCTGCT	99	45.45	388
18	nCoV-2019_80_RIGHT	24444 - 24467	TGGAGCTAAGTTGTTTAACAAGCG	24	41.67	388
19	nCoV-2019_81_LEFT	24292 - 24416	GCACTTGGAAAACTTCAAGATGTGG	25	44.00	497
20	nCoV-2019_81_RIGHT	24766 - 24789	GTGAAGTTCTTTTCTTGTGCAGGG	24	45.83	497
21	nCoV-2019_82_LEFT	24697 - 24721	GGGCTATCATCTTATGTCCTTCCCT	25	48.00	379
22	nCoV-2019_82_RIGHT	25053 - 25076	TGCCAGAGATGTCACCTAAATCAA	24	41.67	379
23	nCoV-2019_83_LEFT	24979 - 25003	TCCTTTGCAACCTGAATTAGACTCA	25	40.00	390
24	nCoV-2019_83_RIGHT	25401 - 25369	TTTGACTCCTTTGAGCACTGGC	22	50.00	390

Таблица 9. Рекомендуемые условия проведения реакции амплификации при использовании праймеров из протокола ARTIC v3. <*>

Матричный режим

1 этап

3 этап <*>

5 этап

6 этап

95 °C - 30 с

55 °C - 10 с

72 °C - 40 с

30 - 35 циклов

72 °C - 2 мин

10 °C - хранение

--------------------------------

<*> Данный температурный режим указан для протокола на основе 00000003.wmz High-Fidelity DNA Polymerase. При использовании других ферментов может потребоваться проведение оптимизации условий реакции.

При невозможности использования праймеров из протокола ARTIC v.3 предлагается использовать альтернативный набор праймеров из протокола ЦНИИЭ (неопубликованные данные) или отдельные праймеры, см. таблица 10.

Таблица 10. Нуклеотидные последовательности и позиции в геноме олигонуклеотидных праймеров для секвенирования гена S SARS-CoV-2 (протокол ЦНИИЭ).

Название праймера	Позиция	Последовательность 5'-3'	Длина	Длина ампликона, пн
Cacv51_F	21420 - 21440	AAG GGG TAC TGC TGT TAT GTC	21	795
Cacv51_R	22195 - 22214	GAG GGA GAT CAC GCA CTA AA	20	795
Cacv52_F	22016 - 22037	TGG ATG GAA AGT GAG TTC AGA G	22	526
Cacv52_R	22518 - 22541	CAA TAG ATT CTG TTG GTT GGA CTC	24	526
Cacv55_F	22407 - 22430	ATG GAA CCA TTA CAG ATG CTG TAG	24	585
Cacv55_R	22971 - 22991	TAC CGG CCT GAT AGA TTT CAG	21	585
Cacv07_F	22842 - 22861	ATG ATT TTA CAG GCT GCG TT	20	637
Cacv08_R	23072 - 23091	CCT GTA GAA TAA ACA CGC CA	20	637
Cacv81_F	23261 - 23282	AGA GAC ATT GCT GAC ACT ACT G	22	585
Cacv81_R	23821 - 23845	TGT ACA AAA ACT GCC ATA TTG CAA C	25	585
Cacv82_F	23684 - 23709	TCT AAT AAC TCT ATT GCC ATA CCC AC	26	538
Cacv82_R	24200 - 24221	TCC AAC CAG AAG TGA TTG TAC C	22	538
Cacv83_F	24122 - 24145	AAG TTT AAC GGC CTT ACT GTT TTG	24	592
Cacv83_R	24690 - 24713	ACA TAA GAT GAT AGC CCT TTC CAC	24	592
Cacv84_F	24587 - 24611	ACT CAA CAA TTA ATT AGA GCT GCA G	25	585
Cacv84_R	25149 - 25171	AAG TTC TTG GAG ATC GAT GAG AG	23	585
Cacv85_F	24810 - 24833	ATG ATG GAA AAG CAC ACT TTC CTC	24	666
Cacv09_R	25281 - 25300	AAA TCT GAA GGA GTA GCA TCC TTG	24	666

Рекомендуемые условия проведения реакции амплификации при использовании праймеров из протокола ЦНИИЭ приведены в таблице 11.

Таблица 11. Рекомендуемые условия проведения реакции амплификации при использовании праймеров из протокола ЦНИИЭ.

Матричный режим

1 этап

3 этап <*>

5 этап

6 этап

95 °C - 5 мин

95 °C - 30 с

52 °C - 30 с

72 °C - 60 с

30 - 35 циклов

72 °C - 5 мин

10 °C - хранение

--------------------------------

<*> Данный температурный режим указан для протокола на основе Taq-полимеразы. При использовании других ферментов может потребоваться проведение оптимизации условий реакции.

Допустимо также использовать праймеры из иных протоколов, позволяющие проводить амплификацию и последующее фрагментное секвенирование последовательности S-гена SARS-CoV-2.

1. Алгоритм дифференциации генетических вариантов вируса SARS-CoV-2 с помощью фрагментного секвенирования по Сэнгеру отдельных локусов гена, кодирующего S-белок 3. Алгоритм дифференциации генетических вариантов вируса SARS-CoV-2 с помощью проведения полногеномного секвенирования