10.4.2. Метод окраски аурамином О

Реактивы:

- спирт этиловый 96° марки ОП-2, ТУ 6-09-4512-77;

- кислота соляная концентрированная, ГОСТ 3118-77;

- фенол кристаллический (карболовая кислота), ГОСТ 6417-72;

- аурамин О-Sigma (2465-27-2);

- акридиновый оранжевый, С.I.46005 или перманганат калия, ГОСТ 10163-76;

- вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72;

- безводный двузамещенный фосфат натрия, ГОСТ 4172-66.

Приготовление растворов:

Раствор 1. Спиртовой раствор аурамина О:

Растворить аурамин в спирте.

Раствор 2. Раствор фенола:

Расплавить кристаллы фенола (температура плавления 41 °C) и растворить его в дистиллированной воде, пользуясь подогреванием на водяной бане. Довести общий объем до 90 мл.

Раствор аурамина О. Смешать растворы 1 и 2 и перелить в плотно закрывающуюся емкость из темного стекла, которую необходимо хранить в прохладном затемненном месте. В процессе хранения раствор может стать мутным, однако это не влияет на качество окрашивания.

Раствор 3. Обесцвечивающий раствор:

Аккуратно добавить концентрированную соляную кислоту к 70° этиловому спирту.

Растворы 4. Гасители фона:

Для дополнительного окрашивания препаратов можно использовать растворы перманганата калия или акридинового оранжевого.

а) Раствор перманганата калия:

Растворить пермганганат калия в дистиллированной воде и перелить в плотно закрывающуюся бутыль из темного стекла. На этикетке обозначить название раствора, дату приготовления и срок годности. Готовый раствор может храниться при комнатной температуре в течение 3 месяцев.

б) Раствор акридинового оранжевого:

Растворить фосфат натрия в дистиллированной воде. Добавить акридиновый оранжевый.

Хранение реактивов. Хранят приготовленные растворы в плотно закрывающейся темной емкости. На этикетке обозначают название раствора, дату приготовления и срок годности. Готовый раствор может храниться при комнатной температуре в темном месте в течение 3 месяцев.

Процедура окраски:

- стекла с фиксированными мазками раскладывают на специальные штативы "рельсы" для окраски так, чтобы они не касались друг друга;

- мазки заливают раствором аурамина О на 15 минут;

- тщательно, но аккуратно промывают мазки дистиллированной водой;

- обесцвечивают раствором 3 (0,5% раствор солянокислого спирта) в течение 2 минут;

- промывают дистиллированной водой каждое стекло до тех пор, пока не смоются все остатки краски;

- гашение фона осуществляют раствором перманганата калия или акридинового оранжевого в течение 2 минут. При использовании перманганата калия время его воздействия не должно превышать 2 минут. Точность экспозиции имеет решающее значение, так как при передержке интенсивность флюоресценции микобактерий может уменьшаться;

- мазки промывают дистиллированной водой;

- мазки высушивают при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении.

Нельзя нагревать мазки и использовать полоски фильтровальной бумаги.