5.2.3. Каталазный тест

Каталаза - это внутриклеточный растворимый фермент, который способен расщеплять перекись водорода на воду и кислород, т.е. обеспечивать следующую химическую реакцию: 2H2O2 = 2H2O + O2. При этом в реагирующей смеси образуются пузырьки кислорода, что указывает на наличие каталазной активности. Почти все виды микобактерий обладают каталазной активностью, за исключением М.bovis и некоторых резистентных к изониазиду штаммов М.tuberculosis.

В клетках микобактерий присутствует ряд изоферментов каталазы, отличающихся по термостабильности. Необходимо отметить, что нетуберкулезные микобактерии и некоторые сапрофиты синтезируют термостабильную каталазу.

При изучении каталазной активности микобактерий используют как качественные, так и количественные тесты:

- качественный (капельный) тест, указывающий на наличие каталазы (выполняется при комнатной температуре);

- полуколичественный тест, указывающий на уровень каталазной активности (измеряется высотой столбика пузырьков в пробирке);

- тест на термостабильность каталазы - тест определения наличия каталазы при 68 °C и pH = 7,0.

Чувствительные к противотуберкулезным препаратам штаммы M.tuberculosis продуцируют каталазу, активность которой определяют капельным методом. При постановке полуколичественного теста столбик пузырьков газа не превышает 45 мм.

ПОСЛЕ ПРОГРЕВАНИЯ БАКТЕРИЙ ПРИ 68 °C И PH = 7,0 В ТЕЧЕНИЕ 20 МИНУТ МИКОБАКТЕРИИ КОМПЛЕКСА M.TUBERCULOSIS ДАЮТ ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ.

Для постановки этих тестов следует использовать двухнедельные культуры, дорощенные на среде Левенштейна-Йенсена при 35 - 37 °C. Для выполнения указанных тестов пробирки с питательной средой помещают в свертыватель для коагуляции в вертикальном положении. При инкубации в стандартных условиях пробирки должны быть закрыты пробками, обеспечивающими газообмен и влажность. Продолжительность инкубации - 14 дней.

Реактивы:

0,067 М фосфатный буферный раствор, pH = 7,0.

Раствор 1:

Растворить навеску Na2HPO4 в дистиллированной воде, чтобы получить 0,067 М раствор.

Раствор 2:

Растворить навеску KH2PO4 в дистиллированной воде, чтобы получить 0,067 М раствор.

Дня получения 0,067 М фосфатного буфера смешать 611 мл раствора 1 и 389 мл раствора 2.

Раствор 3. Перекись водорода, 30%.

30% раствор перекиси водорода (H2O2) хранят в холодильнике.

Проверить, чтобы при постановке теста был использован 30% раствор перекиси водорода, а не 3% раствор, который обычно получают из аптек.

При работе с 30% раствором перекиси водорода используют резиновые перчатки и защитный щиток для глаз.

Раствор 4. 10% твин 80:

Смешать твин 80 с дистиллированной водой и автоклавировать при 121 °C в течение 10 минут. В процессе автоклавирования твин 80 может образовать осадок, который можно растворить при покачивании флакона сразу же после автоклавирования или в процессе охлаждения. Готовый раствор хранить в холодильнике.

Готовый каталазный реагент (смесь твина с перекисью водорода).

Непосредственно перед постановкой теста смешать равные объемы 10% раствора твина 80 и 30% раствора перекиси водорода. Для исследования каждого штамма требуется 1,0 мл каталазного реагента.

Контроли для тестов:

Капельный метод

В качестве отрицательного контроля используют пробирку со средой Левенштейна-Йенсена без инокуляции культурой микобактерий, а в качестве положительного контроля - пробирку с референс-штаммом М.tuberculosis H37Rv, выращенным на среде Левенштейна-Йенсена.

Полуколичественный метод и тест на термостабильность каталазы при 68 °C

В качестве отрицательного контроля используют пробирку со средой Левенштейна-Йенсена без инокуляции культурой микобактерий, а в качестве положительного контроля - пробирку с референс-штаммом М.terrae, выращенным на среде Левенштейна-Йенсена.

Процедура исследования:

Капельный метод

Для постановки теста использовать двухнедельную культуру микобактерий на среде Левенштейна-Йенсена, заранее убедившись в наличии роста микобактерий. В пробирку с ростом микобактерий добавить 1 - 2 капли свежеприготовленной смеси твина 80 с перекисью водорода (готовый каталазный реагент). Наблюдать в течение 5 минут, происходит ли образование пузырьков газа.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

Полуколичественный метод

Для постановки теста использовать двухнедельную культуру микобактерий на среде Левенштейна-Йенсена, заранее убедившись в наличии роста микобактерий. В пробирку с ростом микобактерий добавить 1 мл свежеприготовленной смеси твина-80 с перекисью водорода, плотно закрыть пробирку и оставить на 5 минут при комнатной температуре. В пробирке образуется столбик пены.

Измерить высоту этого столбика от уровня жидкости в пробирке до верхнего края пены.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

Тест на термостабильность катализы при 68 °C и pH = 7,0

ПРОЦЕДУРА ИССЛЕДОВАНИЯ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

В редких случаях может наблюдаться небольшое количество пузырьков, поднимающихся от осадка бактериальных клеток; при этом пена в пробирке не образуется. В таких случаях результаты каталазного теста также считают положительными.