2.4.4. Определение коагулазоположительных стафилококков (S. aureus)

2.4.4. Определение коагулазоположительных стафилококков (S. aureus).

2.4.4.1. Метод основан на способности коагулазоположительных стафилококков расти и образовывать зону просветления вокруг колоний на специальных селективных средах с яичным желтком.

С целью унифицирования метода выделения стафилококков из пищевых продуктов и приближения формулы питательной среды к международной в Институте питания АМН СССР разработан вариант агара типа Байрд-Паркер, близкий по своим свойствам к оригиналу. Для изготовления агара типа Байрд-Паркер используются отечественные реактивы и питательные основы (см. п. 4.2.3.2). Эта среда особенно рекомендуется для выделения стафилококков из продуктов, подвергнутых термической обработке. Преимущество этой среды состоит в том, что с ее применением можно выделять и учитывать стафилококки из большой ассоциации микробов. Под действием ингибирующих веществ среды рост многих представителей сопутствующей микрофлоры полностью угнетается либо изменяется морфология и окраска колоний микроорганизмов.

2.4.4.2. Посев жидких продуктов: в две колбы емкостью 200 куб. см, содержащие по 90 куб. см солевого или сахарного бульона, стерильной пипеткой вносят по 10 куб. см продукта, тщательно смешивают и помещают в термостат при (37 +/- 1) град. C на 18 - 24 часа.

2.4.4.3. Посев пастообразных продуктов (см. табл. 4): из усредненной пробы делают навески, равные 1 г, помещают в пробирки с 9 куб. см солевого и сахарного бульона, хорошо размешивают и термостатируют по п. 2.4.4.2.

2.4.4.4. После термостатирования из бульонов производят посев на чашки Петри с подсушенным агаром типа Байрд-Паркер или ЖСА (п. п. 4.2.3.2 и 4.2.3.3). Посевной материал в количестве 0,1 куб. см (2 капли) равномерно распределяют шпателем по поверхности агара. Чашки с посевами вверх дном инкубируют при (37 +/- 1) град. C в течение 24 - 48 часов.

2.4.4.5. Учет результатов: плазмокоагулирующие стафилококки (S. aureus) на среде типа Байрд-Паркер растут в виде черных, блестящих, выпуклых колоний в диаметре 1 - 1,5 мм, окруженных зоной просветления среды шириной 1 - 3 мм. Около 90% стафилококкус ауреус, выделенных из пищевых продуктов, и штаммы, образующие энтеротоксин, на агаре типа Байрд-Паркер дают зоны просветления через 24 часа инкубации при 37 град. C. Эти колонии не требуют подтверждения в принадлежности к S. aureus и подлежат учету через 24 часа инкубации.

2.4.4.6. При обнаружении вышеописанных колоний дают заключение о наличии S. aureus в засеянной массе продукта и несоответствии его нормативу.

2.4.4.7. При росте типичных по морфологии (п. 2.4.4.5) колоний, но без зон просветления их подвергают изучению в реакции плазмокоагуляции с плазмой крови кролика. При положительной реакции дают заключение о наличии S. aureus в засеянной массе продукта и его несоответствии нормативу.

2.4.4.8. Примечание: некоторые представители семейства Enterobacteriacene, энтерококков, микрококков растут на среде Байрд-Паркер, образуя черные колонии, но при этом ни один из этих микроорганизмов не образует характерных зон просветления на среде с желтком. На этой среде также могут расти дрожжи, плесени, бациллы, но их легко различить по серой окраске и по измененной форме колоний.

2.4.4.9. Учет результатов на желточно-солевом агаре (ЖСА) и изучение выделенных культур, подозрительных на S. aureus, проводится общепринятым методом.

2.4.4.10. Постановка реакции плазмокоагуляции.

Не менее 5-ти характерных колоний, подозрительных на стафилококки, с каждой чашки намечают для дальнейшего исследования, из которых приготавливают мазки-препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют. Колонии грамположительных мелких кокков, расположенных в мазке гроздьевидно, отсеивают в пробирки со скошенным мясопептонным агаром (п. 4.1.3), пробирки с посевами выдерживают в термостате при (37 +/- 1) град. C в течение 18 - 24 часов. Из культур, выросших на скошенном МПА, после предварительной проверки мазка на чистоту под микроскопом, ставят реакцию плазмокоагуляции: в пробирку с (0,50 +/- 0,01) куб. см разведенной кроличьей плазмы (п. 4.2.3.5) вносят петлю суточной агаровой культуры. Одну пробирку с плазмой оставляют незасеянной, а в другую засевают заведомо коагулазоположительный стафилококк в качестве контролей.

Пробирки помещают в термостат при температуре (37 +/- 1) град. C.

Учитывают результаты через 2, 4 часа и оставляют до утра при комнатной температуре для окончательного учета. Ускорение реакции производят за счет использования 3 - 4-часовых бульонных культур стафилококков, добавляя их по (0,10 +/- 0,01) куб. см в (0,50 +/- 0,01) куб. см разведенной цитратной плазмы.

Пробирки на свертывание плазмы следует просматривать осторожно, чтобы не разрушить начало образования сгустка.

При учете реакции плазмокоагуляции могут наблюдаться три степени активности фермента коагулазы:

++++ - сгусток плотный;

+++ - сгусток, имеющий небольшой отсек;

++ - сгусток, в виде взвешенного мешочка.

Все три варианта являются положительным результатом.

2.4.4.11. Обработка результатов:

- положительная реакция плазмокоагуляции свидетельствует о присутствии коагулазоположительных стафилококков в засеянной массе (объеме) продукта;

- отрицательная реакция плазмокоагуляции свидетельствует об отсутствии коагулазоположительных стафилококков в засеянной массе (объеме) продукта.

2.4.4.12. Примечание.

При обнаружении значительного роста коагулазоотрицательных стафилококков в исследуемом продукте микробиолог должен обратить внимание на санитарно-гигиеническое содержание молочной кухни, т.к. у детей грудного возраста некоторые варианты коагулазоотрицательных стафилококков (S. epidermidis) также способны вызывать острые стафилококковые энтериты.