5.3. Двухэтапный метод концентрирования вирусов (сорбция на ионообменной смоле и осаждение с помощью сульфата аммония)

5.3.1. Область применения.

Метод рекомендуется для концентрирования вируса гепатита А и энтеровирусов из проб питьевой воды и воды водоисточников. Объем проб может колебаться от 10 до 50 л.

5.3.2. I этап. Концентрирование и элюция вируса гепатита А и энтеровирусов из проб воды при помощи сорбции на ионообменной смоле.

В качестве сорбента используют смесь, состоящую из ионообменной смолы АВ-17-8 (подготовленной в соответствии с п. 5.2.2) и гидроксида алюминия, которой заполняют стеклянную бюретку (колонку) диаметром 36 - 38 мм и длиной 250 - 300 мм. Колонка должна иметь в нижней части впаянную перегородку из пористого стекла (стеклянный фильтр Шотта N 2) и резиновый шланг, присоединенный к нижнему концу колонки. После установки колонки в штативе в нее вносят ионообменную смолу (высота столбика смолы должна составлять не менее 30 - 40 мм) и навеску гидроксида алюминия (8 - 10 г).

Исследуемую пробу воды в бутылях или канистре подкисляют с помощью соляной кислоты до рН 3,0 - 4,5, располагают выше колонки и через резиновую трубку с пробкой для колонки подают воду в колонку, регулируя скорость прохождения с помощью винта на резиновой трубке, присоединенной к нижнему концу колонки. Скорость прохождения воды через колонку должна составлять 10 - 15 мл/мин.

После прохождения исследуемой воды через колонку нижний резиновый шланг перекрывают и осуществляют элюцию вируса с адсорбента при помощи 0,05 М глицинового буфера с рН 11,5, который вносят в колонку в объеме 100 мл. Адсорбент в колонке и элюент тщательно перемешивают и выдерживают в течение 10 - 15 мин. Затем элюат удаляют из колонки через нижний резиновый шланг и с помощью глицинового буфера с рН 1,5 устанавливают рН элюата на уровне 7,0 - 8,0.

Приготовление глицинового буфера с рН 11,5.

Навеску 0,385 г аминоуксусной кислоты растворяют в 100 мл дистиллированной воды и получают глицин. К 50 мл глицина добавляют 50 мл 0,1 N раствора гидроксида натрия и получают глициновый буфер с рН 11,5.

Для приготовления глицинового буфера (рН 1,5 - 1,6) к 38 мл глицина добавляют 62 мл 0,1 N раствора соляной кислоты.

5.3.3. II этап. Вторичное концентрирование антигена и энтеровирусов - осаждение с помощью сульфата аммония.

Вторичное концентрирование (осаждение) вирусов проводят на

холоде. Для этого к элюату дробно (в течение 20 - 30 мин.)

добавляют 1/2 объема насыщенного раствора сульфата аммония

((NH ) SO ), тщательно перемешивают и оставляют на ночь. Утром

4 2 4

смесь центрифугируют в течение 1 ч при 5 - 6 тыс. об./мин.

Супернатант сливают, а осадок растворяют в 1 - 2 мл

физиологического раствора с рН 7,2 - 7,4.

При необходимости концентрат делят на 2 части, одну из

которых исследуют на наличие антигена ВГА, другую подвергают

антибактериальной обработке в соответствии с п. 5.1.6 и используют

для заражения тканевых культур с целью выделения энтеровирусов.

Приготовление насыщенного раствора сульфата аммония.

В 1 л теплой стерильной дистиллированной воды (30 - 35 °С)

растворяют 800 г сульфата аммония ((NH ) SO ). Полученный раствор

4 2 4

фильтруют, доводят до рН 7,2 и охлаждают в холодильнике.

5.3.4. Хранение проб (см. п. 5.1.7).

5.2. Метод концентрирования вирусов с использованием ионообменных смол 5.4. Метод концентрирования вирусов с использованием двухфазного разделения