Таблица 3

Праймеры, необходимые для проведения ПЦР, входят в состав готовой стандартной тест-системы.

8.6.3.2. Расчет рабочих концентраций праймеров.

Поставку праймеров производителем осуществляют в количествах, измеряющихся в оптических единицах (ОЕ) на мл. Для расчета рабочих концентраций праймеров необходимо перевести ОЕ в мкМ. Для праймера длиной А пар нуклеотидов (п.н.), поставляемом в количестве В ОЕ, пересчет осуществляют следующим образом:

- определяют молекулярную массу (ММ) одноцепочечной ДНК (оцДНК) по формуле:

ММ = 330 дальтон (ММ 1 п.н.) х А;

- определяют концентрацию праймера, исходя из того, что 1 ОЕ оцДНК соответствует концентрации 37 мкг/мл, соответственно В ОЕ соответствуют концентрации 37 х В мкг/мл;

- определяют концентрацию праймера С в мкМ:

С = (37 х В х 1000) / (330 х А) (мкМ).

Ряд организаций - производителей обратной транскриптазы в инструкциях по постановке реакции обратной транскрипции указывают не концентрацию праймеров в мкМ, а количество праймера, добавляемое в реакцию (в pmol). В этом случае пересчет ОЕ в pmol следует производить по формуле:

D = B / (0,01 х А),

где D - количество праймера (в pmol), содержащееся в 1 мкл раствора.

8.6.3.3. Постановка реакции обратной транскрипции.

Для обратной транскрипции можно использовать готовые стандартные наборы реагентов, разрешенные к применению для этих целей в Российской Федерации в установленном порядке. В состав наборов входят буферный раствор и фермент - обратная транскриптаза (ревертаза) различного происхождения. Ингибитор РНКаз и смесь ДНТФ некоторые производители поставляют отдельно. Все компоненты реакционной смеси для обратной транскрипции можно приобретать по отдельности.

Постановка:

- в 0,2 мл (или 0,5 мл) пробирки вносят: 10,0 - 14,5 мкл РНК пробы, 10 - 20 pmol прямого праймера НП1;

- смесь аккуратно перемешивают, осаждают центрифугированием (5 с при 5000 об./мин. или с использованием вортекса) и помещают в термоциклер на 70 °С 10 мин.;

- по истечении времени нагревания пробирки достают и помещают на лед;

- в пробы добавляют: 5х или 10х буфер для обратной транскрипции (конечная концентрация - 1х), 1 мкл ДНТФ (100 - 200 мкМ), обратную транскриптазу (100 - 200 ед.), ингибитор РНКаз (20 ед.). Общий объем реакционной смеси составляет 20 мкл. Объем реакционной смеси при необходимости доводят с помощью свободной от РНКаз воды;

- смесь перемешивают, осаждают центрифугированием и выдерживают при комнатной температуре 10 - 15 мин.;

- пробирки помещают в термоциклер и выдерживают 50 мин. при 37 - 42 °С (время и температуру, необходимые для работы фермента, указывают в инструкции производителя).

После синтеза кДНК на РНК матрице пробы используют для ПЦР-амплификации.

8.6.3.4. Полимеразная цепная реакция.

Амплификацию полученной в реакции обратной транскрипции кДНК осуществляют с использованием тест-системы для амплификации участка кДНК энтеровирусов длиной 207 п.н. (кат. N V-16-100-R0,5 или кат. N V-16-100-R0,2) в соответствии с прилагаемой инструкцией.

8.6.4. Анализ амплифицированной ДНК, учет результатов.

Для анализа амплифицированной ДНК используют разные методы, наиболее простым из которых является гель-электрофорез. Для постановки электрофореза можно использовать комплект стандартных реагентов для электрофореза в агарозном геле (кат. N К5-200) в соответствии с инструкцией производителя.

Учет результатов проводят визуально с помощью трансиллюминатора. При этом агарозный гель либо достают из кюветы и помещают на стекло трансиллюминатора, либо используют емкости из УФ-проницаемых материалов.

При постановке ОТ-ПЦР для выявления в пробе "минус" цепи РНК энтеровирусов, положительные образцы должны содержать полосу ДНК размером 207 п.н. Размер полосы определяют по соотношению с положительным контролем и ДНК-маркером. Результаты можно документировать посредством фотографирования или видеосъемки геля с использованием ультрафиолетовых фильтров.

8.6.5. Интерпретация результатов, полученных с использованием культур тканей методом ОТ-ПЦР.

Выявление негативной РНК ("минус" цепи РНК) энтеровирусов в пробе исследуемой воды с помощью ОТ-ПЦР зараженных культур клеток свидетельствует о присутствии в ней инфекционных энтеровирусов и интерпретируется как положительный результат молекулярного теста на инфекционность энтеровирусов.