5.1. Метод концентрирования вирусов с использованием фильтрующих мембран

5.1.1. Область применения.

Метод используют для концентрирования вирусов из питьевой воды различных видов (водопроводной, бутылированной, из родников и др.), воды подземных водоисточников, воды из бассейнов и других чистых вод. Объем исследуемой воды составляет 10 л. При необходимости объем воды может быть увеличен. Время концентрирования данным методом из 10 л составляет в среднем 1,5 - 2,5 ч. Для концентрирования используют фильтрующие мембраны из нитроцеллюлозы типа ФМНЦ, ФМПА и мембраны микропористые капроновые (ММК) или другие, равные по эффективности.

5.1.2. Подготовка мембранных фильтров.

Фильтрующие мембраны должны быть подготовлены к анализу в соответствии с указаниями организации-изготовителя (листовка-аннотация, сопровождающая фильтры). Перед исследованием фильтрующие мембраны смачивают стерильной водопроводной водой в стерильной емкости.

5.1.3. Подготовка фильтровального аппарата.

Для фильтрования исследуемой воды используют установку, например, типа АФ-142 "К" или другую с аналогичными характеристиками, которая состоит из фильтродержателя, емкости на 10 и более литров для исследуемой воды и ее последующей фильтрации и устройства, нагнетающего жидкость.

Перед фильтрацией фильтродержатель протирают ватным тампоном, смоченным спиртом ректификованным 70%, и обжигают. После охлаждения на нижнюю часть фильтродержателя кладут стерильным пинцетом влажный мембранный фильтр, предварительно смоченный в стерильной водопроводной воде. Затем фильтр прижимают верхней частью фильтродержателя и закрепляют зажимами, равномерно завинчивая последние со всех сторон.

5.1.4. Фильтрование воды.

Исследуемый объем воды наливают в напорную емкость, крышку тщательно закрепляют зажимами, включают подачу давления (1,5 - 2,0 бара), после чего воду направляют в фильтродержатель со скоростью около 100 мл/мин. и фильтруют через мембрану. При использовании для концентрирования мембран, например, типа ФМНЦ, в исследуемую воду добавляют хлористый магний до конечной концентрации 0,05 М или хлористый алюминий до конечной концентрации 0,0005 М для увеличения сорбционной способности мембраны. При использовании фильтров ММК хлористый магний не добавляют.

5.1.5. Элюция сконцентрированных вирусных частиц.

Элюцию вирусов с мембран проводят 20 мл элюента с соблюдением всех правил эпидемической безопасности (перчатки, маска, спецодежда и т.д.) в ламинарном боксе. После окончания фильтрования откручивают зажимы и снимают верхнюю часть фильтродержателя. Мембрану осторожно приподнимают за край пинцетом, стерилизованным путем обжигания и переносят в стерильную емкость, соответствующую диаметру мембраны (может быть использована тарелка, чашка Петри диаметром не менее 142 мм и др.). Затем на поверхность мембраны наносят 10 мл элюента (3% бифэкстракт на трисбуфере с рН 9,1 - 9,5) и стерильной пипеткой с целым концом проводят механический смыв (соскабливанием и струей) вируса с поверхности мембраны в течение нескольких минут. К концу манипуляции мембрана должна приобрести первоначальный вид. Полученный элюат переносят в стерильный флакон. Затем на эту же мембрану наносят второй объем (10 мл) того же элюента и проводят вторичное смывание вирусов струей с обеих сторон мембраны, и вторую часть элюата помещают в тот же флакон, что и первую. Затем рН полученного элюата доводят до 7,0 - 7,5 1 N раствором соляной кислоты.

5.1.6. Обработка проб.

Для удаления бактериальной микрофлоры элюат подвергают обработке одним из двух методов: обработкой хлороформом или фильтрацией через стерилизующие мембраны.

5.1.6.1. При использовании хлороформа его добавляют в элюат (1 мл на 10 мл элюата), интенсивно встряхивают 10 мин. и центрифугируют 10 мин. при 2000 об./мин. для разделения фаз. Водную фазу (верхнюю) аккуратно отбирают пипеткой в стерильный флакон, добавляют 100 МЕ/мл пенициллина и 10,0 мг/мл стрептомицина.

5.1.6.2. При использовании стерилизующих насадок с фильтрами 0,22 мкм элюат пробы переносят в стерильный шприц объемом 5 - 20 мл с установленной фильтрующей насадкой и поршнем шприца продавливают в стерильный флакон. Этот способ позволяет избежать использования антибиотиков, токсичного хлороформа и связанных с этим мер безопасности, не требует длительного встряхивания и центрифугирования.

5.1.7. Хранение проб.

Стерильные элюаты хранят до испытания при 4 °С не более 24 ч. При температуре -20 °С их можно хранить в течение 1 года. При необходимости многократного исследования элюат делят на несколько порций, чтобы избежать повторного замораживания.