5.1. Использование генотипирования ВИЧ и филогенетического анализа при проведении эпидемиологического расследования случаев ВИЧ-инфекции

5.1. Использование генотипирования ВИЧ и филогенетического

анализа при проведении эпидемиологического расследования

случаев ВИЧ-инфекции

Генотипирование и филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей необходимо использовать в качестве дополнительного инструмента при проведении эпидемиологического расследования случаев ВИЧ-инфекции, предположительно связанных с оказанием медицинской помощи, или других сложных (с эпидемиологической точки зрения) случаев.

Филогенетический анализ может применяться с целью обеспечения дополнительной доказательной базы при определении связанности лиц - участников цепи передачи ВИЧ-инфекции. Методика может позволить сузить круг поиска предполагаемых источников заражения при недостатке эпидемиологических данных и выявить наиболее вероятный источник заражения при наличии нескольких вариантов. Метод филогенетического анализа обладает очень высокой ценностью отрицательного результата при ограниченной ценности положительного результата.

Для определения связи между биологическими образцами от пациентов предположительно из одной эпидемиологической цепи (исследуемая группа) необходимо провести генотипирование образцов крови от всех инфицированных ВИЧ из предполагаемого очага передачи ВИЧ-инфекции, а также образцов крови от инфицированных лиц из группы сравнения. В исследуемую группу необходимо включить пострадавшего/их и лицо/лиц, потенциально являющегося(ихся) для него источником инфекции. В группу сравнения (контрольную группу) необходимо включить не менее 20 - 30 образцов крови, полученных от ВИЧ-инфицированных из того же географического региона, социальной группы, группы риска заражения и инфицированных ВИЧ, в близкие (к исследуемой группе) сроки. Дополнительно в качестве контрольной группы возможно использовать охарактеризованные нуклеотидные последовательности из баз данных, подобранных по аналогичным критериям.

Образцы для проведения генотипирования должны быть направлены с сопроводительным письмом, каждый образец при этом должен сопровождаться заполненным бланком "Направления на генотипирование ВИЧ" (прилож. 4). Все образцы для генотипирования должны иметь свой индивидуальный номер в соответствии с бланком направления, тот же номер должен быть нанесен на пробирку с пробой.

В зависимости от уровня ВН у пациентов из исследуемой группы (инфицированные ВИЧ из предполагаемого группового очага заболевания) и доступности биологических образцов производится выбор вида доставляемого материала. Субстратом для получения нуклеотидных последовательностей для филогенетического анализа может быть использована как вирусная РНК, так и провирусная ДНК. В рамках проведения одного анализа должен быть использован только один тип субстрата для всех образцов как исследуемой группы, так и группы сравнения. Невозможно провести генотипирование образцов от пациентов с неопределяемой ВН, длительно получающих эффективную АРТ.

Если ВН всех образцов из исследуемой группы составляет более 1 000 копий/мл, для каждого пациента из обеих групп на исследование должно быть направлено не менее 1 - 2 мл плазмы крови.

В том случае, если ВН хотя бы у одного пациента из исследуемой группы окажется менее 1 000 копий/мл, то на исследование от такого пациента должны быть направлены пробирки с 5 - 10 мл цельной крови с ЭДТА или не менее 2 аликвот, содержащих лейкоциты плазмы крови.

Ввиду высокой разрешающей способности методики филогенетического анализа следует на всех этапах лабораторной работы минимизировать потенциально возможные технические ошибки, приводящие к контаминации, а также исключить вероятность неправильной маркировки образцов. Для минимизации ошибок во время проведения анализа и для подтверждения его результатов можно рекомендовать исследовать два образца от пациентов из исследуемой группы, забранных в разное время.

Для получения нуклеотидных последовательностей могут быть использованы как методы популяционного секвенирования, так и массового параллельного секвенирования с предварительным специфическим обогащением (например, ПЦР) или без него. По причине большей стандартизации рекомендуется использование наборов реагентов, предназначенных для определения лекарственной устойчивости ВИЧ, в том случае если они позволяют получить нуклеотидные последовательности в необходимом для анализа объеме. По каждому образцу необходимо получить нуклеотидные последовательности достаточной длины (не менее 500 пар нуклеотидов) для 2 - 3 регионов вирусного генома. Следует использовать гены с различными функциями и различной скоростью эволюции (обычно env, pol, pro/rev, int.). Полученные последовательности необходимо объединить в единый файл и провести их выравнивание. После проведения выравнивания все нуклеотидные последовательности должны быть обрезаны по краям для приведения их к одинаковой длине.

Филогенетический анализ полученных последовательностей проводится с использованием специализированного биоинформатического программного обеспечения с обязательным проведением бутстреп-анализа. Результатом филогенетического анализа является филогенетическое дерево, которое является визуальным отображением генетической дистанции между изучаемыми образцами.

При анализе структуры филогенетического дерева попарно оцениваются отношения между образцами исследуемой группы и группы сравнения. В случае если образец из исследуемой группы кластеризуется отдельно от других образцов исследуемой группы (генетическая дистанция между ним и образцами группы сравнения меньше, чем между ним и другими образцами исследуемой группы), можно сделать вывод о том, что по результатам филогенетического анализа данный образец и остальные образцы исследуемой группы эпидемиологически не связаны друг с другом. В случае если образец из исследуемой группы кластеризуется совместно с другими образцами исследуемой группы (генетическая дистанция между ним и образцами из группы сравнения больше, чем между ним и другими образцами исследуемой группы) можно сделать вывод о том, что результаты филогенетического анализа указывают на возможную эпидемиологическую связь между образцами в исследуемой группе.

Заключение по результатам филогенетического анализа содержит следующую информацию: детали применяемой методики, количество исследованных образцов, полученные филогенетические деревья, все выявленные субтипы ВИЧ у обследованных, генетическая дистанция между образцами разных групп, выводы.