3. Методика анализа проникающей способности

В ходе эксперимента должна быть установлена пассивная диффузия исследуемого действующего вещества. Наличие пассивной диффузии действующего вещества подтверждается на подходящей тест-системе, клетки которой экспрессируют известные эффлюкс-транспортеры. Одним из способов подтверждения пассивной диффузии является установление отсутствия зависимости измеренной проникающей способности in vitro действующего вещества и его исходной концентрации (например, отсутствие такой зависимости для дозировок, которые составляют 0,01, 0,10 и 1,00 от наибольшей дозировки действующего вещества, растворенной в 250 мл среды). Также пассивная диффузия может быть подтверждена путем оценки направления переноса действующего вещества (эффлюкс-отношения, то есть отношения кажущейся проникающей способности действующего вещества (Р_каж) между базолатерально-апикальным направлением клетки и апикально-базолатеральным направлением клетки), которое должно составлять < 2 для выбранных концентраций действующего вещества. Эффлюкс-отношение рассчитывается по следующей формуле:

где:

- кажущаяся проникающая способность действующего вещества в базолатерально-апикальном направлении;

- кажущаяся проникающая способность действующего вещества в апикально-базолатеральном направлении.

Функциональную экспрессию эффлюкс-транспортеров необходимо проверять с использованием исследований двунаправленного транспорта, подтверждающих асимметричную проникающую способность выбранных субстратов для эффлюкс-транспортеров (например, дигоксина, винбластина, родамина 123) используемых в ненасыщающих транспортеры концентрациях.

Концентрации исследуемого действующего вещества, используемые в исследованиях проникающей способности, должны быть обоснованы заявителем. В валидированной методике анализов проникающей способности действующего вещества на линии клеток Caco-2, необходимо использовать условия, установленные во время валидации методики, и включить модельные действующие вещества с умеренной и хорошей проникающей способностью в донорскую жидкость вместе с исследуемым действующим веществом в качестве внутренних стандартов для подтверждения постоянства методики указанного анализа. Выбор внутренних стандартов должен основываться на их совместимости с исследуемым действующим веществом, то есть они не должны проявлять какие-либо существенные физические, химические и опосредованные переносом взаимодействия с исследуемым действующим веществом. Проникающая способность внутренних стандартов может быть определена после оценки исследуемого действующего вещества в тех же монослоях линии клеток Caco-2 или монослоях клеток на том же планшете, если невозможно включить внутренние стандарты в ту же клеточную культуру, в которой оценивалась проникающая способность исследуемого действующего вещества. Полученные в серии различных испытаний, а также при валидации методики анализа значения проникающей способности внутренних стандартов должны коррелировать (быть близкими) между собой. В отчете должны быть указаны критерии приемлемости для внутренних стандартов и модельного субстрата для эффлюкс-транспортера. Необходимо указать среднее высвобождение действующего вещества и внутренних стандартов в конце испытания. При высвобождении действующего вещества < 80% должна быть выполнена оценка материального баланса, включая измерение остаточного количества действующего вещества в монослое линии клеток Caco-2 и в буферной среде которая находится в приборе для испытаний.

Оценку проникающей способности исследуемого действующего вещества для его классификации по БКС можно упростить в случае выбора внутреннего стандарта с хорошей проникающей способностью, значение которой находится вблизи установленной границы между умеренной и хорошей проникающей способностями. В этом случае исследуемое действующее вещество считается обладающим хорошей проникающей способностью, если значение его проникающей способности равно или превышает значение проникающей способности для выбранного внутреннего стандарта с хорошей проникающей способностью.

Сведения, необходимые для обоснования хорошей проникающей способности исследуемого действующего вещества (среднее значение проникающей способности, его стандартное отклонение, коэффициент вариации) должны включать в себя:

данные о проникающей способности исследуемого действующего вещества;

данные о проникающей способности использованных внутренних стандартов;

данные о желудочно-кишечной стабильности действующего вещества in vitro;

данные, обосновывающие механизм пассивной диффузии действующего вещества.

Таблица

Примеры модельных действующих веществ для валидации методики

анализа проникающей способности действующего вещества

с использованием линии клеток Caco-2