Методика анализа проникающей способности действующего вещества с использованием линии клеток Caco-2

допустимость использования для валидации метода на клетках Caco-2 при оценке класса действующего вещества по БКС за счет установления in vitro проникающей способности путем пассивной диффузии указанных в таблице, приведенной в приложении N 1 к Требованиям, 12 модельных действующих веществ, которые подвергаются активному транспорту (4 из 12 модельных действующих веществ подвергаются активному эффлюксу (дигоксин, паклиткасел, хинидин и винбластин), остальные 8 веществ подвергаются активному транспорту (фуросемид - переносчиком OAT3, метформин - переносчиками OCT1 и OCT2, амилорид - переносчиком OCT2, фамотидин - переносчиком OCT2, ацикловир - переносчиками OAT1 и OCT1, теофиллин - переносчиком OAT2 и эналаприл - переносчиками PepT1 и PepT2)

результаты сравнения проникающих способностей 24 действующих веществ, представленные в научной медицинской и химико-фармацевтической литературе (Pharm Res (19) 2002 и Drug Discover Today (17) 2012) и полученные на тощей кишке человека и в линии клеток Caco-2 in vivo и in vitro, имели хорошую корреляцию для веществ, абсорбируемых пассивной диффузией, и несколько худшую для активного транспорта. Поэтому монослои клеток Caco-2 могут использоваться для прогнозирования пассивной диффузии действующих веществ у человека, тогда как прогнозирование активного транспорта с помощью систем переносчиков может быть менее точным, учитывая измененную экспрессию переносчиков этой клеточной линией. Соответственно модельные лекарственные препараты, для определения хорошей проникающей способности, являются быстро (пассивно) проникающими лекарственными препаратами, такими как напроксен, антипирин и метопролол с сопоставимыми коэффициентами проникающей способности на клетках Caco-2 и в тощей кишке человека. Несмотря на то, что некоторые модельные лекарственные препараты частично подвергаются активному транспорту, проникающие способности их действующих веществ на монослоях клеток линии Caco-2 имеют надежную корреляцию с проникающей способностью in vivo. Поскольку экспрессия переносчиков клеточными линиями может отличаться от условий in vivo, эта корреляция не является универсальной для всех действующих веществ, переносимых активным транспортом. В связи с этим без представления доказательных in vivo данных in vitro данные не являются единственным способом определения класса проникающей способности действующих веществ, переносимых активным транспортом. Окончательный вывод о действующем веществе, классифицируемом как хорошо проникающее действующее вещество с помощью анализа на монослое клеток линии Caco-2, будет возможен только для действующих веществ, не переносимых никаким активным транспортом.

допустимость использования биовейвера, основанного на БКС, для действующих веществ с низкими показателями K_m, если выполняются все следующие условия:

а) данные in vitro для действующего вещества, подвергаемого эффлюксу в клетках линии Caco-2, позволяют получить кажущееся значение K_m значительно ниже, чем соответствующие концентрации этого действующего вещества в кишечнике;

б) активность процесса эффлюкса достигает насыщения при всех концентрациях действующего вещества, а проникающая способность действующего вещества определяется только его пассивной диффузией;

в) клиническая фармакокинетика действующего вещества человека является линейной;

г) представлены вспомогательные данные, например данные по фармакокинетике (абсорбции, распределении, метаболизме, элиминации) у человека

отсутствие эффлюкса или насыщение эффлюкс-переносчиков невозможно экспериментально различить, если используемые физиологически обоснованные концентрации (например, в соответствии с приложением N 1 к Требованиям в 0,01, 0,10 и 1,00 от наибольшей дозировки лекарственного препарата, растворенной в 250 мл среды) превышают значение K_m действующего вещества. В этом случае действующее вещество считается хорошо проникающим, если кажущаяся проникающая способность (Р_каж) больше или равна Р_каж референтного модельного лекарственного препарата с большой проникающей способностью. Анализ с использованием клеток Caco-2 при этом должен быть валидирован, подтверждая двунаправленный характер транспорта известных модельных лекарственных препаратов (таблица, приведенная в приложении N 2 к Требованиям) и доказывать функциональную активность эффлюкс-переносчика (переносчиков). Если при этом возможно представить in vivo данные, показывающие хорошую проникающую способность действующего вещества в соответствии с настоящими Требованиями (то есть данные по фармакокинетике (абсорбции, распределении, метаболизме, элиминации) у человека или абсолютную биодоступность), класс хорошей проникающей способности для действующего вещества также может быть присвоен. Необходимо учитывать, что для действующих веществ класса III по БКС, не соответствующих критериям класса хорошей проникающей способности, вариант биовейвера, основанного на БКС, также доступен, если выполняются все условия в соответствии с Требованиями.

допустимость исключения из рассмотрения по биовейверу, основанному на БКС, транспортируемых действующих веществ для которых клетки линии Caco-2 не позволяют надежно классифицировать проникающую способность

к активно транспортируемым действующим веществам применимы условия, описанные для действующих веществ с низкими показателями K_m. Активно транспортируемые действующие вещества не исключаются из рассмотрения по биовейверу, основанному на БКС, если in vivo данные, полученные в исследованиях с участием человека, позволяют обосновать принадлежность действующего вещества к классу веществ с хорошей проникающей способностью. Для данного случая не допускается исключительное использование анализа проникающей способности методом ее изучения на клетках Caco-2 (поскольку экспрессия переносчиков системами Caco-2 может отличаться от экспрессии in vivo).

допустимость обоснования порога эффлюкс-отношения больше 2 с помощью модельных соединений (наборов данных из валидационных результатов) в случае отдельных валидированных моделей монослоев клеток Caco-2 для которых эффлюкс-отношение больше 2 является более приемлемым

в отсутствие какого-либо активного транспорта (абсорбции или эффлюкса), отношение между абсорбционным Р_каж (в направлении от апикального к базолатеральному или "") и Р_каж "" должно быть равно 1 или быть близким к такому значению. Любое отклонение от 1 будет указывать на некоторый вклад активного транспорта в процесс переноса действующего вещества. Эффлюкс-отношение больше 2 принято в качестве порога, указывающего на то, что действующее вещество является субстратом эффлюкс-переносчика.

работы, в которых приводятся данные по выбору модельных лекарственных препаратов для валидации метода оценки проникающей способности действующих веществ

соответствующие данные приведены в следующих работах:

Volpe DA. Application of Method Suitability for Drug Permeability Classification. AAPS J. 2010; 12(4): 670 - 8;

Li C. et al. Development of In Vitro Pharmacokinetic Screens Using Caco-2, Human Hepatocyte, and Caco-2/Human Hepatocyte Hybrid Systems for the Prediction of Oral Bioavailability in Humans. Journal of Biomolecular Screening 2007; 12(8): 1084 - 1091;

Peng Y. et al. Applications of a 7-day Caco-2 cell model in drug discovery and development. European Journal of Pharmaceutical Sciences 2014; 56: 120 - 130;

Kasim NA et al. Molecular Properties of WHO Essential Drugs and Provisional Biopharmaceutical Classification. Molecular Pharmaceutics 2004; 1(1): 85 - 96;

, H. Intestinal permeability and its relevance for absorption and elimination, Xenobiotica 2007; 37(10): 1015 - 1051;

Thiel-Demby VE. Biopharmaceutics Classification System: Validation and Learnings of an In Vitro Permeability Assay. Molecular Pharmaceutics 2009; 6(1): 11 - 18;

Giacomini, et al. Nat Rev Drug Discov. 2010; 9: 215 - 236;

FDA, United States In Vitro Metabolism-and Transporter-Mediated Drug-Drug Interaction Studies Guidance for Industry (October 2017).