6.1. Методы для скрининга

61. Использование скрининговых методов является первым шагом в оценке иммуногенности. Методы должны быть чувствительными и способными обнаруживать все клинически значимые антитела (включая подклассы IgM и IgG), индуцированные введением лекарственного препарата, у всех серопозитивных пациентов (то есть во всех серопозитивных образцах). Желателен низкий уровень ложноположительных результатов (предпочтительно 5%), при этом ложноотрицательных результатов не должно быть.

62. Скрининг проводится с использованием иммунологических методов, которые базируются на разнообразных способах и системах обнаружения, описанных в приложении в настоящей главе. Все методики скрининга направлены на выявление взаимодействия между антигенами и антителами (связывание), но основываются на разных научных (технических) принципах. Эти методики характеризуются достаточно высокой производительностью, выполнение соответствующих процедур автоматизировано, каждая методика имеет свои особенности и соответствующие ограничения, которые необходимо учитывать (в соответствии с главой 10 настоящих Правил).

63. Методы должны быть разработаны, подобраны, оптимизированы и валидированы в соответствии с их предполагаемым использованием. При выборе скрининговых методик необходимо учитывать все методологические проблемы и мешающие факторы, которые могут повлиять на результаты тестирования. Например, иммуноферментный анализ (ELISA), основанный на прямом связывании с антигеном, который непосредственно иммобилизован на поверхности пластиковых лунок, является самым простым для выполнения методом, при этом такой анализ характеризуется высокой частотой выявления ложноположительных результатов. Кроме того, для такого типа методов характерна высокая частота ложноотрицательных результатов при тестировании образцов, содержащих низкоаффинные антитела. Для исключения методологических проблем необходимо предусмотреть возможность использования других подходящих видов анализа, например, таких как модифицированный иммуноферментный анализ (brindging assays), электрохемилюминесценция или поверхностный плазмонный резонанс, с учетом их ограничений. При использовании некоторых скрининговых методик возможно маскирование эпитопов, что приводит к получению ложноотрицательных результатов. Данная проблема решается, например, путем маркировки детектирующих реагентов с использованием процедур, которые предотвращают маскирование определенного эпитопа (эпитопов).

64. Реагенты, используемые при выполнении анализа (например, блокирующие реагенты), необходимо тщательно изучить. Блокирующие реагенты, такие как BSA и молоко, содержат нечеловеческие гликаны, которые иногда могут присутствовать в составе белковых препаратов, полученных с использованием клеток животных, отличных от человека. В этой связи индуцированные антитела, направленные к этим гликанам, при выполнении методики анализа могут не обнаруживаться.

65. Образцы (обычно сыворотка или плазма) содержат вещества, которые могут мешать проведению анализа, оказывая матриксные эффекты, что приводит к получению ложноположительных или отрицательных результатов и (или) некорректному определению уровня содержания антител (например, компоненты комплемента или рецепторы комплемента, маннозосвязывающий белок, Fc рецепторы, растворимые молекулы-мишени и ревматоидный фактор). Влияние таких матриксных компонентов на результаты анализа необходимо рассматривать и оценивать при проведении валидации методики. Чтобы ослабить потенциальное влияние эффекта матрикса, необходимо выполнить корректирующие меры и обосновать выбранный подход, с учетом наличия ограничений соответствующих методов. Кроме того, остаточное содержание терапевтического белка (лекарственного препарата), присутствующего в крови пациента, может образовывать комплексы с индуцированными антителами и вследствие этого снижать поддающуюся обнаружению концентрацию антител. Эта интерференция может различным образом влиять на методику, в зависимости от ее разновидности, формата и типа, а также характеристики антител. Вопросы, связанные с указанными обстоятельствами, необходимо решать во время валидации методики. Если такое влияние присутствия остаточного содержания лекарственного препарата выявляется, его можно преодолеть (разрешить), используя различные методические приемы (например, путем диссоциации иммунных комплексов с помощью кислоты, удалением избыточного количества лекарственного препарата путем твердофазной абсорбции, использованием длительного периода инкубации и (или) использованием метода, позволяющего проводить анализ образцов при его высоких разведениях). В некоторых случаях допускается удалить из образца остаточное содержание лекарственного препарата или антиген-мишень, используя лектины или ксеногенные антитела. Такие подходы должны быть валидированы в отношении их эффективности и должно быть показано, что они не оказывают негативного влияния на конечные результаты анализа. В некоторых случаях интерференция остаточного содержания терапевтического белка не допускается путем отбора проб для оценки антител спустя достаточное количество времени после введения препарата, что позволяет ему элиминироваться из кровотока до отбора проб. Однако такой подход не должен значительно усложнять процесс обнаружения антител и влиять на схему лечения пациента. Заявитель должен продемонстрировать, что на чувствительность методики по выявлению антител в образцах не влияет определенный уровень терапевтического белка, который выше уровня содержания в тестируемых образцах на наличие антител. Из-за технических ограничений не всегда есть возможность разработать полностью нечувствительные методики к присутствию терапевтического белка. Необходимо использовать наилучший из возможных вариантов анализа, выбранный подход должен быть надлежащим образом обоснован.