2. Обоснование анализа экспрессирующей конструкции

Цель анализа экспрессирующей конструкции - подтвердить, что в клетку-хозяина внедрена правильная кодирующая последовательность продукта и она поддерживается в ней в течение культивирования до окончания производственного процесса. Генетическая последовательность рекомбинантных белков, синтезируемая в живых клетках, может подвергаться мутациям, способным изменить свойства белка, что может привести к негативным последствиям у пациентов. Ни один экспериментальный подход не позволяет выявить одновременно все возможные модификации белков. Для изучения аминокислотной последовательности и структурных особенностей экспрессирующегося белка, обусловленного посттрансляционными модификациями, например, протеолитическим процессингом, гликозилированием, фосфорилированием и ацетилированием, допускается использование методов белкового анализа. Белковый анализ может не выявить все изменения структуры рекомбинантного белка, обусловленные мутациями в кодирующей его последовательности. В этом случае данные анализа нуклеиновых кислот могут представлять особое значение. Относительная важность анализа нуклеиновых кислот и белков для разных препаратов различается.

Анализ нуклеиновых кислот можно применять для верификации кодирующей последовательности, а также для оценки физического состояния экспрессирующей конструкции. Анализ нуклеиновых кислот проводят, чтобы убедиться, что экспрессируемый белок имеет правильную аминокислотную последовательность, однако этот метод не предназначен для обнаружения малых количеств вариантных последовательностей. Если клетки-продуценты содержат множество встроенных копий экспрессирующей конструкции, не все из которых транскрибируются, наиболее подходящим методом может быть исследование самих продуктов транскрипции при помощи анализа мРНК или кДНК, а не исследование геномной ДНК. Аналитические подходы, направленные на изучение всей совокупности нуклеиновых кислот, например, проводимые на пуле клонов или материале, амплифицированном при помощи полимеразной цепной реакции, можно рассматривать как альтернативу методам, зависящим от отбора отдельных клонов ДНК. Возможно использование других методик, позволяющих быстро и с достаточной чувствительностью верифицировать в экспрессирующей конструкции последовательность, кодирующую рекомбинантный белок.

В настоящей главе описываются данные, которые следует учитывать при составлении характеристики экспрессирующей конструкции в процессе разработки и валидации производственного процесса. Аналитические методики должны пройти валидацию для подтверждения способности обнаружения последовательности. Валидационная документация должна по меньшей мере включать расчет пределов обнаружения вариантных последовательностей, для этого необходимо провести валидацию методик секвенирования нуклеиновых кислот либо белков. Принципы и рекомендации по анализу, описанные в настоящей главе, необходимо регулярно пересматривать для учета новых технических достижений и научных данных.