6.2.4. Учет и анализ результатов

6.2.4.1. Выживаемость рыб определяется путем систематического учета живых и погибших рыб на протяжении всего опыта (в острых опытах через 24, 48 и 96 ч, в хронических - через 5, 10 и далее через каждые 10 суток опыта). Полученные данные обобщают и выражают в абсолютных и процентных величинах. Устанавливают границы выживания рыб в зависимости от концентрации вещества и времени его воздействия на организм. Находят переносимую концентрацию вещества, которая не вызывает гибели рыб.

6.2.4.2. Прирост или снижение ихтиомассы устанавливают на основе данных периодического взвешивания рыб в хроническом опыте (каждые 10 суток). Этот показатель выражают в процентах от начальной массы или индивидуально.

6.2.4.3. Клиническую картину (симптомы отравления) оценивают по изменению поведения рыб в водной среде и реакции на внешние раздражители путем периодического осмотра их в опыте. Изменение поведения и местонахождения рыб в воде может свидетельствовать о поражении многих систем организма.

С повышением токсичности вещества чаще наблюдается тенденция к подъему рыб в поверхностные слои при наличии возбуждения или общего угнетения, дискоординации движений, расстройств дыхания и других патологических признаков. Незадолго до гибели большая часть рыб опускается на дно.

При отравлениях реакции рыб на внешние раздражители могут усиливаться, ослабевать или полностью исчезать. В качестве раздражителей при проведении токсикологических исследований можно использовать стук по стенкам аквариума, включение и выключение света, всплеск воды в аквариуме, прикосновение сачком или стеклянной палочкой к телу рыб, искусственно создаваемый ток жидкости путем слива или слабого вращения воды при помощи лопаточки и другие приспособления.

Несмотря на некоторые различия в развитии процесса отравления рыб ядами, как правило, наблюдают следующие стадии интоксикации - начало беспокойства (учащение дыхательного ритма, беспокойное дыхание, отставление плавников), первые признаки расстройства чувствительности (судорожное дыхание, поднятие лучей плавников, неполное закрытие рта), усиление раздражимости (стремительное плавание или неподвижность, сильная реакция на внешние раздражители или полное ее отсутствие), первое расстройство координации движений (кратковременное опрокидывание на бок или на спину, кружение вокруг продольной оси тела, толчкообразные движения), полная потеря равновесия (стабильное изменение положения тела, плавание на боку, вверх брюшком по кругу и штопорообразно, дрожание мышц и плавников, судороги тела), агония (опускание на дно аквариума, удушье, паралич). Все эти признаки регистрируют через 24, 48 и 96 ч в острых опытах и через 5, 10 и далее через каждые 10 суток в хронических опытах. Выявляют концентрацию вещества, при которой не проявляются внешние признаки интоксикации.

На основании сачковой пробы оценивают резервную силу организма рыб по времени трепетания на сачке. Отловленных взрослых рыб из растворов с разными концентрациями вещества помещают на плоскодонный сачок и регистрируют время прекращения трепетания, оценивают характер и силу движений. Полученные данные сравнивают с результатами, полученными на рыбах из контрольных аквариумов, а в естественных условиях - из незагрязненных водных объектов или контрольных участков. При острых, подострых и хронических токсикозах всегда отмечается резкое сокращение времени трепетания рыб. Полученные результаты сводят в таблицы, подвергают статистической обработке и по графической зависимости времени трепетания от концентрации вещества устанавливают пороговую и недействующую концентрации.

6.2.4.4. Характер питания зависит от вида рыб и от особенности поедания корма. Хищные рыбы (радужная форель, лосось и др.) активно набрасываются на корм, стараясь поймать его на лету у поверхности воды. Мирные рыбы (карп, сазан) корм берут спокойно, заглатывая его в толще воды или собирая на дне аквариума. При отравлениях эти реакции угнетаются или полностью подавляются. При явных признаках интоксикации рыбы полностью отказываются от корма. В конце экспериментов устанавливается концентрация раствора, при которой не происходит нарушения рефлекса питания.

6.2.4.5. Характер и частота дыхания. Наблюдения ведутся через 24, 48 и 96 ч в острых опытах и через 5, 10 и далее через каждые 10 суток в хронических опытах путем оценки силы, частоты и ритма дыхательных движений жаберных крышек с помощью секундомера по отношению к контролю в течение 1 - 10 минут. Нормальное дыхание у рыб характеризуется спокойными, ритмичными, умеренной силы (амплитуда) и частоты колебательными движениями жаберных крышек. Норма устанавливается в каждом конкретном случае на здоровых рыбах. При отравлениях можно наблюдать различные расстройства дыхания, в том числе резкое учащение колебательных движений жаберных крышек, беспорядочное дрожание жабр с последующей остановкой дыхания, периодическое прекращение и возобновление учащенных или замедленных дыхательных движений с увеличенной или уменьшенной амплитудой колебательных движений жаберных крышек.

6.2.4.6. Внешний вид (состояние кожных покровов, плавников, органов зрения). Хорошее состояние рыб характеризуется энергичностью, округлостью спины, упругостью мышц, полным упругим животом с наличием полостного жира во внутренних органах при нормальном состоянии печени. Истощенные рыбы характеризуются как вялые, пассивные, с опавшей и заостренной спиной, запавшими глазами, подтянутым животом, мягкой мускулатурой, истонченной брюшной стенкой и отсутствием полостного жира на внутренних органах. Состояние отдельных органов и систем организма оценивают в конце опыта и у погибших рыб в течение эксперимента общими методами исследования (вскрытие, осмотр, определение запаха, измерение, фотографирование и зарисовки). Используют также разнообразные специальные методы исследования (микроскопия, электрокардиография, рентгенография, запись дыхания и др.). При отравлениях могут быть обнаружены самые разнообразные изменения в органах и тканях рыб, которые в совокупности характеризуют особенности течения того или иного токсикологического процесса.

На коже часто обнаруживают изменения слизистого покрова, покраснения (гиперемия), кровоизлияния, новообразования (опухоли), рубцы, эрозии, язвы, ерошение и выпадение чешуи, появление налетов и выделение слизи. Аналогичные изменения возникают на плавниках, которые иногда деформируются и разрушаются вплоть до оголения лучей. Мускулатура рыб при отравлениях может стать дряблой, водянистой, тургор ослабляется, при надавливании пальцем обнаруживается медленно выправляющаяся вмятина. Нередко наблюдаются парезы, параличи, уплотнение или расслабление отдельных групп мышц головы, туловища и хвостового стебля с соответствующими искривлениями тела. Глаза больных рыб застланы пеленой, тусклые, помутневшие, с бледным рисунком. Иногда обнаруживаются пучеглазие, кровенаполнение сосудов, кровоизлияние в переднюю, заднюю камеры и ткани глаз.

6.2.4.7. Состояние жаберного аппарата. Осмотр производится при жизни и после гибели рыб под водой и в воздушной среде. Рыб отлавливают, заворачивают в марлевую салфетку, отводят пальцем жаберную крышку в сторону и осматривают жабры визуально или с помощью лупы. Осмотр жабр под водой производится путем погружения рыбы на глубину 3 - 5 см, при этом многие патологические изменения гораздо лучше заметны, чем при осмотре в воздушной среде. В норме жабры полнокровные, ярко-красного цвета, чистые, жаберные лепестки ровные, лежат параллельно, соприкасаясь друг с другом, свободный край их образует ровный полукруг относительно жаберной дужки. При отравлениях рыб жабры приобретают различные оттенки - темно-вишневый, красный, бледно-красный, бледный желтовато-розовый, темно-бурый, сероватый и др. Жаберные лепестки набухают и лежат беспорядочно.

6.2.4.9. Гистологические и гистохимические свидетельства поражения органов и тканей рыб могут наблюдаться и в отсутствие клинических симптомов интоксикации. Для исследований берут только свежий материал - от живых или находящихся в состоянии агонии рыб либо от только что погибших особей. В хронических опытах фиксацию органов подопытных рыб следует производить в конце опытов. Для изучения воздействия токсических веществ гистологическому и гистохимическому исследованию подвергают жабры, печень, почки, желудочно-кишечный тракт, половые продукты, селезенку, поджелудочную и щитовидную железы, головной мозг, сердце, мышцы туловища, кожные покровы. Для сравнения обязательно фиксируют и исследуют органы и ткани контрольных рыб. После вскрытия рыбы материал немедленно фиксируется во избежание обезвоживания и деформации поверхностных слоев клеток. Толщина кусочков органов для фиксации должна быть не более 1 см, чтобы фиксирующая жидкость легко и быстро проникала в ткань. Сроки фиксации для разных фиксаторов различны, как правило, они тем короче, чем выше температура фиксатора. При использовании большинства фиксаторов наилучшие результаты дает длительная фиксация (3 - 5 минут) при температуре от 1 до 18 °C. Объем фиксирующей жидкости должен в 15 - 20 раз превышать объем фиксируемых кусочков. Мелкие органы фиксируются целиком, из крупных вырезают пластинки с таким расчетом, чтобы на гистологических препаратах были как нормальные, так и изменившиеся части органа. Во избежание разрушения внутренние органы рыхлой консистенции, особенно мелких рыб, фиксируют вместе с близлежащими тканями. Хорошими фиксаторами служат жидкость Буэна, 5 - 10%-й нейтральный формалин, смесь спирта, формалина и уксусной кислоты, жидкость Карнуа. При оценке изменений описывают общую микроскопическую картину и данные гистохимических исследований (на гликоген, жир и др.).

Морфологические изменения у рыб при воздействии токсических веществ не всегда являются строго специфическими для каждого яда, чаще всего по ним можно определить, к какой группе относится ядовитое вещество. Гистохимические реакции и электрономикроскопические исследования более чувствительны и позволяют точнее определить пороговую концентрацию.

6.2.4.10. Гематологические и биохимические показатели широко используются в ихтиопатологии, ветеринарии, медицине, в токсикогигиенических исследованиях. Они углубляют представление о динамике интоксикации организма гораздо раньше, чем появляются внешние признаки отравления рыб. Определяют следующие показатели: количество эритроцитов и лейкоцитов, эритроцитарные картины и морфология форменных элементов крови, размеры клеток крови, общий белок, активность пероксидазы (каталазы) или холинэстеразы.

Для взятия крови рыбу завертывают в марлевую салфетку. Место, откуда предполагают взятие крови, освобождают от слизи и избытка влаги ватно-марлевым тампоном. Пробы крови получают из жаберной вены путем введения тонко оттянутой пастеровской пипетки в жаберный сосуд нижней трети жаберной дужки, а также из сердца с помощью полой иглы или пастеровской пипетки. Место укола в сердце лежит в середине линии, соединяющей основание правого и левого грудных плавников. Иглу вводят в сердце под углом 45° относительно фронтальной плоскости тела рыб. Кровь можно также отобрать из хвостовой артерии после отрезания хвоста или с помощью полой иглы или пастеровской пипетки, погружая их на медиальной линии позади анального плавника под углом 45° до упора в позвоночник рыбы. Взятая кровь быстро свертывается, поэтому необходимо в возможно более короткий срок (40 - 50 секунд) взять максимальное количество проб на определение различных гематологических и биохимических показателей.

В качестве антикоагулянта применяют гепарин или лимоннокислый натрий в виде порошка или 3,8% раствора, которым ополаскивают пробирки, или добавляют 1/4 часть раствора к объему крови. Для определения общего белка антикоагулянт не добавляют, а оставляют пробирки с кровью в теплом месте для отделения плазмы и получения сыворотки.

Отбор проб крови и анализ проводят в следующей последовательности:

а) берут кровь от рыб;

б) приготавливают мазок крови;

в) заряжают меланжер для количественного подсчета форменных элементов крови или отбирают пробы крови в пробирку с раствором хлористого натрия для определения количества эритроцитов фотоколориметрическим методом на эритрогемометре;

г) заряжают гемометр Сали для определения содержания гемоглобина крови или отбирают пробы крови для определения этого показателя на эритрогемометре;

д) определяют содержание гемоглобина в крови по методу Сали или на эритрогемометре;

е) подсчитывают число эритроцитов и лейкоцитов в камере Горяева или на эритрогемометре;

ж) фиксируют и окрашивают взятые мазки крови;

з) подсчитывают количество лейкоцитов и определяют эритроцитарные картины; - определяют общий белок сыворотки крови методом Лоури;

и) исследуют пероксидазную активность по методу Попова и Нейковска.

Приемы и методы гематологических анализов описаны в соответствующих руководствах (Кудрявцев А.А., Кудрявцев Л.А., Привольнов Т.Н. Гематология животных и рыб. М.: Колос, 1969; Балаховский С.Д., Балаховский И.С. Методы химического анализа крови. М.: Медгиз, 1953).

6.2.4.11. Органолептические свойства и вкусовые качества бульона и мяса рыб. После вскрытия и обследования по показателям, приведенным выше, рыб обмывают чистой питьевой водой, помещают в стаканы или колбы, заливают чистой питьевой водой в соотношении 5 частей воды на 1 часть рыбы и без добавления соли варят в течение 5 - 10 мин. на слабом огне. После охлаждения до комнатной температуры у сваренных контрольных и опытных рыб вырезают кусочки спинных мышц весом 0,2 - 0,5 г (в зависимости от веса рыбы). Кусочки мяса помещают в рыбный бульон, разлитый по нумерованным чашкам Петри. Порядок нумерации чашек Петри с контрольными и подопытными рыбами оглашается дегустаторам только после окончания дегустации. Для проведения дегустации приглашается 3 - 5 человек. Испытатели отмечают цвет бульона, присутствие или отсутствие постороннего запаха, а затем цвет и присутствие или отсутствие постороннего запаха мяса рыб.

После этого определяют вкусовые качества мяса рыб и наличие постороннего привкуса. В норме вкус мяса рыб сладковатый. После дегустации образец продукта выбрасывают в банку, полость рта ополаскивают питьевой водой. Результаты дегустации испытатель вносит, не оглашая, в таблицу по форме 8.