5.2.2. Тест на наличие нитратредуктазы

При дифференциации микобактерий туберкулеза применяется также реакция восстановления нитратов в нитриты. Реакция восстановления нитратов дает возможность дифференцировать микобактерии человеческого вида, обладающие нитратредуктазой, от микобактерий бычьего и птичьего видов и от некоторых нетуберкулезных микобактерий, у которых этот фермент отсутствует. Из всех микобактерий нитратредуктазная активность наиболее выражена у M.tuberculosis. Это позволяет использовать данный тест в сочетании с ниациновым тестом для дифференциальной диагностики M.tuberculosis и микобактерий других видов.

Для определения способности микобактерий редуцировать нитраты используют 4-недельные культуры с обильным ростом, выращенные на среде Левенштейна-Йенсена.

Принцип метода заключается в определении активности нитратредуктазы по количеству восстановленного нитрита из нитрата, что сопровождается цветной реакцией с парадиметиламинобензальдегидом.

5.2.2.1. Классический метод

Приготовление реактивов

Раствор 1. Нитрат натрия в фосфатном буфере.

0,01 М раствор нитрита натрия в 0,022 М фосфатном буферном растворе (pH = 7,0) готовится следующим образом:

А. 3,02 г KH2PO4 растворить в 1000 мл дистиллированной воды.

Б. 3,16 г Na2HPO4 растворить в 1000 мл дистиллированной воды.

В. 611 мл раствора Б добавить к 389 мл раствора А, хорошо смешать (величина pH раствора должна составлять 7,0).

В 1000 мл полученного буферного раствора (В) растворить 0,85 г NaNO3.

Разлить полученный раствор 1 в емкости по 100 мл. Стерилизовать в автоклаве при 121 °C в течение 15 минут. При необходимости этот раствор можно переносить по 2 мл в пробирки с завинчивающимися крышками.

Раствор 2. Раствор соляной кислоты.

Медленно влить концентрированную соляную кислоту в дистиллированную воду, чтобы получить разведение 1:1.

НИКОГДА НЕ ВЛИВАЙТЕ ВОДУ В КИСЛОТУ!

Хранить полученную смесь в герметически закрытой бутыли из темного стекла в холодильнике.

Раствор 3. Раствор сульфаниламида (0,2%).

Растворить сульфаниламид в дистиллированной воде. Хранить полученную смесь в герметически закрытой бутыли из темного стекла в холодильнике.

Раствор 4. Раствор N-нафтилэтилендиамина (0,1%).

Растворить нафтилэтилендиамин в дистиллированной воде. Хранить полученную смесь в герметически закрытой бутыли из темного стекла в холодильнике.

Контроль реактивов

Перед выполнением теста необходимо проконтролировать пригодность реактивов:

отрицательный контроль - тест с экстрактом из пробирки с незасеянной средой;

положительный контроль - тест с экстрактом референс-штамма М.tuberculosis H37Rv.

ПРОЦЕДУРА ВЫПОЛНЕНИЯ КЛАССИЧЕСКОГО ТЕСТА

Результаты и их интерпретация

Отрицательный результат - окрашивания нет. Если раствор остается бесцветным, это означает, что результат теста отрицательный или что процесс восстановления прошел слишком быстро, при этом нитриты восстановились до нитридов. Для того чтобы убедиться в истинности результата, необходимо добавить в пробирку немного порошка цинка (небольшой объем порошка цинка перенесите из флакона на кончике слегка увлажненного аппликатора).

а) Если в растворе остался нитрат, цинк катализирует реакцию и появится красное окрашивание, что свидетельствует об истинно отрицательном результате теста.

б) Если после добавления порошка цинка красного окрашивания раствора не произошло, это означает, что результат теста положителен, но процесс восстановления прошел стадию нитрита.

Повторить тест, чтобы подтвердить его результат.

Градации интенсивности окраски:

Бледно-розовая = +/-

Розовая = 1+

Темно-розовая = 2+

Красная = 3+

Темно-красная = 4+

Пурпурно-красная = 5+.

Положительным результат считают только в тех случаях, когда интенсивность окраски составляет от 3+ до 5+.

5.2.2.2. Модифицированный метод с использованием бумажных полосок

Для определения способности бактерий редуцировать нитраты можно использовать коммерческие бумажные полоски. При использовании данной модификации нитратредуктазного теста надежные результаты получаются в тех случаях, когда микобактерии интенсивно редуцируют нитраты (например, М.tuberculosis). Поэтому при идентификации микобактерий туберкулеза этот метод дает вполне приемлемые результаты и позволяет сократить трудозатраты, хотя стоимость бумажных полосок значительно выше.

ПРОЦЕДУРА ВЫПОЛНЕНИЯ ТЕСТА

Результаты и их интерпретация

Отрицательный результат - отсутствие окрашивания.

Положительный результат - верхняя часть полоски приобретает красный цвет (оттенок от розового до темно-красного).

Предосторожности

Перед проведением теста убедиться, что срок годности коммерческих тест-полосок не истек.

Полоски чувствительны к солнечному свету, а также к повышенной температуре и влажности, поэтому их следует хранить в оригинальной упаковке в непрозрачном контейнере с крышкой при температуре 2 - 8 °C.

Не следует использовать обесцвеченные полоски. Если полоски обесцветились, они подлежат уничтожению, так как произошло снижение активности реагента.

Результаты следует расценивать как сомнительные, если в положительном контроле получены слабоположительные или отрицательные результаты.

Стандарты интенсивности окраски, характеризующие активность нитратредуктазы

Чтобы обеспечить унификацию положительных результатов теста по выявлению способности микобактерий восстанавливать нитраты, рекомендуется использовать заранее приготовленную серию стандартов, соответствующих различной активности нитратредуктазы. Активность этой ферментной системы выражается в интенсивности окраски - от "+/-" до "5+" (см. выше). Эти стандарты можно хранить неопределенно долго и использовать при каждой постановке нитратредуктазного теста.

Реагенты

Растворы:

1. 0,067 М раствор фосфата натрия двузамещенного (9,47 г безводного Na2HPO4 на 1000 мл воды).

2. 0,067 М раствор фосфата калия однозамещенного (9,07 г KH2PO4 на 1000 мл воды).

3. 0,067 M раствор фосфата натрия трехзамещенного (25,47 г Na3PO4 x 12H2O на 1000 мл воды).

4. 1% спиртовой раствор фенолфталеина (1 г на 100 мл 95% этилового спирта).

5. 1% спиртовой раствор бромтимолового синего (1 г на 100 мл 95% этилового спирта).

6. 0,01% раствор бромтимолового синего: внести 1,0 мл 1% раствора бромтимолового синего в 100 мл дистиллированной воды.

Рабочий буферный раствор:

Смешать 35 мл раствора N 1, 5 мл раствора N 2 и 100 мл раствора N 3.

7. К 10 мл рабочего буферного раствора добавить 0,1 мл раствора N 4 и 0,2 мл раствора N 6.

Процедура:

Поставить в штатив 8 чистых пробирок (пробирки N 1 - 8).

Внести 2 мл рабочего буферного раствора в 7 пробирок (с N 2 до N 8).

Внести 2 мл раствора N 7 в пробирку N 1. Это - цветовой стандарт, соответствующий реакции максимальной интенсивности ("5+").

В пробирку N 2 внести 2 мл раствора N 7. Хорошо перемешать и перенести 2 мл в следующую пробирку (N 3). Продолжить серию двукратных разведений вплоть до пробирки N 8, из которой вылить 2 мл смеси.

В результате будут получены следующие цветовые стандарты:

пробирка N 1 = 5+

пробирка N 2 = 4+

пробирка N 3 = 3+

пробирка N 5 = 2+

пробирка N 6 = 1+

пробирка N 8 = +/-.

Автоклавировать пробирки, закрыть их герметично и хранить при 5 °C.