2.3. Лабораторные диагностические исследования

У 80% пациентов манифестация заболевания характеризуется лейкопенией (медиана числа лейкоцитов составляет 1,8 x 10⁹/л). Если у пациента в момент диагностики ОЛ определяется лейкопения < 1 x 10⁹/л, особенно в сочетании с гипофибриногенемией, то с большой долей вероятности можно предполагать промиелоцитарный вариант ОМЛ. У 15 - 20% пациентов в дебюте болезни выявляется лейкоцитоз (медиана 83 x 10⁹/л) с увеличением числа лейкоцитов до 150 x 10⁹/л. У подавляющего числа пациентов (80 - 90%) определяется анемия, причем у половины из них концентрация гемоглобина составляет < 100 г/л. У 75% пациентов содержание тромбоцитов снижается до 50 x 10⁹/л. Лабораторные признаки диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС) и истощенного фибринолиза определяются у 80 - 90% пациентов [4].

В большинстве случаев диагноз может быть заподозрен при морфологической оценке лейкемических клеток. Для этого необходимо получить цитологический препарат костного мозга (КМ) путем пункции. Бластные клетки при ОПЛ у большинства пациентов прежде всего характеризуются значительным ядерным полиморфизмом и наличием крупной фиолетово-бурой зернистости, густо заполняющей цитоплазму, большим количеством палочек Ауэра (классический гипергранулярный вариант ОПЛ) [6]. У 15 - 20% пациентов в цитоплазме опухолевых клеток обнаруживается лишь несколько мелких гранул или они не выявляются вовсе, при этом все остальные признаки (клинические, цитохимические, цитогенетические) ОПЛ присутствуют.

Классическим признаком опухолевых клеток ОПЛ является очень выраженная цитохимическая реакция на миелопероксидазу (MPO), липиды, которая выявляется с помощью суданового черного (SBB), и на хлорацетатэстеразу.

Рекомендуется всем пациентам до начала и во время лечения ОПЛ выполнение общего анализа ПК с подсчетом лейкоцитарной формулы и определением числа ретикулоцитов и тромбоцитов для верификации диагноза, контроля за лечением и выработки тактики ведения пациента [1 - 3, 5].

Уровень убедительности рекомендации - C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: общий анализ ПК (особенно число лейкоцитов и тромбоцитов) выполняется ежедневно в первые дни терапии ATRA** для оценки риска возникновения дифференцировочного синдрома (ДС) (при быстром увеличении числа лейкоцитов целесообразно начать профилактику ДС, даже если не было исходного лейкоцитоза; уровень тромбоцитов не должен быть < 30 x 10⁹/л, целевой уровень 50 x 10⁹/л), затем - через день - два до констатации ремиссии. Развернутая формула - 2 раза в неделю.

Рекомендуется до начала лечения ОПЛ для верификации диагноза всем пациентам выполнить цитологическое и цитохимическое исследования опухолевых клеток в пунктате КМ, и всем больным после окончания программы индукции ремиссии, в ходе консолидации и поддерживающей терапии выполнять контрольное цитологическое исследование аспирата КМ, оценку ответа на лечение, оценку состояния костномозгового кроветворения и диагностику рецидива [1 - 3, 5].

Уровень убедительности рекомендации - C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: у пациентов с ОПЛ после курса ХТ наблюдается две волны выхода из агранулоцитоза. Первую контрольную пункцию КМ следует выполнять не ранее завершения второй волны выхода, в среднем на 30-й день после завершения курса ХТ. Более ранний анализ пунктата КМ может привести к ложному подсчету процента бластных клеток - продолжающих дифференцироваться опухолевых клеток, которые через 7 - 10 дней полностью исчезнут из КМ. Таким образом, первая контрольная пункция КМ осуществляется в среднем на 30-й день после последнего введения идарубицина** (то есть на 36 - 40-й день от начала курса) или при окончательном восстановлении показателей ПК.

У пациентов, индукционное лечение которым выполняют ATO в сочетании с ATRA**, описанная выше закономерность отсутствует. При применении ATO у большого числа пациентов в течение первых 2 недель терапии отмечается постепенное увеличение числа лейкоцитов в ПК (лейкоцитоз может достигать 150 - 180 x 10⁹/л), что при отсутствии клинических признаков дистресс-синдрома терапии не требует. В ряде случаев при лейкоцитозе может наблюдаться оссалгический синдром, требующий обезболивания.

Рекомендуется всем пациентам до начала лечения ОПЛ выполнить иммунофенотипическое исследование опухолевых клеток в пунктате КМ для повышения точности диагностики ОПЛ [1 - 3, 5, 7].

Уровень убедительности рекомендации - C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: иммунофенотипирование с использованием многоцветной проточной цитометрии может повысить точность морфологических исследований ОПЛ, но не является ключевым методом диагностики. Как правило, PML/RARA-положительные бластные клетки имеют иммунофенотип, аналогичный нормальным промиелоцитам (CD34-/+ гетерогенный, CD117-/+ dim, HLADR-/+ dim, CD13+/++, CD11b-). Тем не менее в отличие от нормальных промиелоцитов PML/RARA-положительные промиелоциты имеют крайне низкий уровень CD15 (CD15-/+ dim вместо CD15+++). Бластные клетки при гипогранулярной (вариантной) форме ОПЛ (M3V) часто коэкспрессируют T-линейные маркеры, такие как CD2, совместно с миелоидными маркерами, такими как CD13 и CD33.

Рекомендуется всем пациентам до начала лечения ОПЛ выполнить цитогенетическое исследование, а также для получения быстрого ответа о наличии химерного гена PML-RARA - определение экспрессии pML-RAR-a (количественное), молекулярно-генетическое исследование мутаций в гене PML-RARA методом ПЦР для верификации диагноза и выполнения в дальнейшем мониторинга минимальной остаточной болезни (МОБ) [1 - 3, 5].

Уровень убедительности рекомендации - C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: все случаи ОПЛ, установленного морфологическими и цитохимическими методами исследования, должны быть подтверждены методом ПЦР или FISH в момент установления диагноза, так как в 5 - 10% случаев при отсутствии классической t (15; 17) обнаруживается транскрипт PML-RARA.

Для диагностики ОПЛ крайне необходимым является быстрое цитогенетическое подтверждение диагноза. Поскольку эффективность таргетного лечения на основе ретиноидов и/или производных мышьяка строго зависит от наличия химерного гена PML/RARA, генетическое подтверждение диагноза является обязательным во всех случаях. В 1977 г. J.D. Rowley и соавт. было доказано, что практически во всех случаях ОПЛ обнаруживается t (15; 17) (q22; q12-21) [8]. В результате этой транслокации ген промиелоцитарного лейкоза (PML-ген), расположенный на хромосоме 15, переносится на длинное плечо хромосомы 17 в область, где находится ген альфа-рецептора ретиноевой кислоты (эту транслокацию относят к группе реципрокных, сбалансированных, что означает, что генетический материал не утрачивается и передается с одной хромосомы на другую. В результате t (15; 17) появляется 2 сливных аномальных гена: на деривате хромосомы 15 и на деривате хромосомы 17.

Генетическое подтверждение диагноза должно выполняться, если возможно, на бластных клетках, полученных из КМ. Идентификация ОПЛ-специфических генетических поломок в бластных клетках осуществляется на уровне анализа хромосом, ДНК, РНК и химерного белка с использованием стандартного кариотипирования, флуоресцентной in situ гибридизации (FISH), полимеразно-цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) или анти-PML моноклональных антител. Соответственно, каждый из методов имеет свои преимущества и недостатки.

Кариотипирование на G-окрашенных метафазах, полученных из образцов КМ, выполняется обычными методами на прямой 24- и 48-часовой культуре. Несмотря на высокую специфичность, цитогенетический анализ , отнимает много времени, нуждается в метафазах хорошего качества (потери до 20%) и по определению не в состоянии обнаружить случаи, когда PML/RARA является результатом так называемой криптогенной перестройки (ложноотрицательный результат).

Этот метод позволяет обнаруживать дополнительные хромосомные перестройки, но они не имеют существенного прогностического значения при ОПЛ. Цитогенетический анализ может быть полезен в тех случаях ОПЛ, когда синтез химерного белка PML/RARA не осуществляется. Стандартная цитогенетика также может способствовать выявлению редких вариантов ОПЛ в том числе с t (11; 17) (q23; q21), t (11; 17) (q13; q21) и t (5; 17) (q35; q21), приводящих к синтезу химерных продуктов PLZF-RARA, NuMA RARA и NPM1-RARA соответственно, а также другим, описанным совсем недавно. FISH-анализ на выполняется с использованием флуоресцентных зондов. Хотя в некоторых случаях образцы ПК пригодны для исследования (в частности, когда на момент установления диагноза имеется гиперлейкоцитоз), FISH-анализ лучше выполнять на образцах КМ. Этот метод высокоспецифичен, обладает достаточной чувствительностью, намного дешевле и менее трудоемок, чем кариотипирование. Однако FISH не дает никакой информации об изоформе химерного транскрипта PML/RARA, который необходим для осуществления молекулярного мониторинга МОБ.

Тем не менее FISH может быть полезен в диагностике предполагаемых случаев ОПЛ, при которых не выявляется химерный транскрипт PML-RARA. Так, FISH-исследование может выявить реаранжировку гена RARA, который может быть партнером другого - не PML-гена.

В клиниках, в которых нет возможности выполнить цитогенетическое исследование, диагноз должен быть подтвержден в референс-лаборатории. Образцы КМ или ПК должны быть доставлены в лабораторию до начала терапии.

ОТ-ПЦР-анализ PML-RARA проводят на РНК, выделенной из клеток КМ, хотя химерный транскрипт, как правило, легко определяется и в ПК даже в случаях с лейкопенией. ОТ-ПЦР-анализ для выявления химерного продукта PML-RARA был создан и стандартизован в рамках международной кооперации. ОТ-ПЦР является "золотым стандартом" для подтверждения диагноза ОПЛ. Важно, что помимо высокой специфичности и чувствительности он определяет расположение точки разрыва PML, устанавливая тем самым маркер для следующего мониторинга МОБ. Однако малое количество РНК (и, как следствие, ложноотрицательный результат), контаминация/артефакты (ложноположительный результат), а также относительно длительный период подготовки проб (около 2 дней) являются основными недостатками этого метода. Кроме того, очень желательно, чтобы детекцию химерных транскриптов и мониторинг образцов проводили в референс-лабораториях с хорошо обученным персоналом и большим опытом.

Определение молекулярного варианта ОПЛ (PML-RARA, PLZF-RARA, NuMA-RARA, NPM-RARA и др.) может подсказать, чувствительны ли опухолевые клетки к воздействию ATRA** и мышьяка. Варианты ОПЛ с PLZF-RARA-онкогеном плохо отвечают на терапию ретиноидами.

Рекомендуется всем пациентам до начала лечения ОПЛ (с целью уточнения варианта мутации) и во время лечения ОПЛ (для выполнения мониторинга МОБ) проведение молекулярного исследования транскриптов гена bcr-1, bcr-2 и bcr-3 в КМ [9, 10].

Уровень убедительности рекомендации - C (уровень достоверности доказательств - 4)

Комментарии: в клиниках, в которых нет возможности выполнить молекулярное исследование, диагноз должен быть подтвержден в референс-лаборатории. Образцы КМ или ПК должны быть доставлены в лабораторию до начала терапии. Варианты транскрипта (bcr1, bcr2, bcr3) и экспрессия транскрипта служат маркерами для мониторинга МОБ при ОПЛ с t (15; 17), но не определяют прогноз заболевания.

Рекомендуется всем пациентам до начала и во время лечения ОПЛ в ходе терапии проведение анализа биохимического анализа крови (общий белок, альбумин, мочевина, креатинин, калий, натрий, кальций, лактатдегидрогеназа, щелочная фосфатаза, аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, билирубин общий, свободный и связанный) для диагностики сопутствующей патологии (заболеваний) и определения тактики сопроводительной терапии [1 - 3, 5].

Уровень убедительности рекомендации - C (уровень достоверности доказательств - 5)

Рекомендуется всем пациентам до начала и во время лечения ОПЛ в ходе терапии исследование свертывающей системы крови (активированное частичное тромбопластиновое время, протромбиновое время, тромбиновое время, фибриноген) для диагностики сопутствующей патологии и осложнений, а также определения тактики сопроводительной терапии [1, 2, 11].

Уровень убедительности рекомендации - C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: у пациентов с малейшими признаками коагулопатиии на этапе индукции ремиссии все указанные показатели должны мониторироваться ежедневно. Если есть возможность, в систему мониторинга целесообразно включить тромбоэластографию.

Не рекомендуется рутинное молекулярно-генетическое исследование мутации гена FLT3 (fms-подобная тирозин-киназа-3) в ПК или КМ всем пациентам с ОПЛ [2, 3].

Уровень убедительности рекомендации - C (уровень достоверности доказательств - 4)

Комментарии: мутации в гене, кодирующем FMS-подобную тирозинкиназу-3 (FLT3), при ОПЛ наблюдаются чаще, чем при других ОМЛ - у 30 - 40% пациентов. Однако, хотя FLT3-мутации ассоциированы с более высоким числом лейкоцитов в момент диагностики ОЛ, они не являются каким-либо прогностическим фактором и не оказывают влияние на выбор терапевтической тактики.