2.3 Лабораторные диагностические исследования

- Рекомендуется всем пациентам при подозрении, диагностике ОМЛ, а также в ходе терапии с частотой от ежедневного до ежемесячного, выполнение общего (клинического) анализа крови с дифференцированным подсчетом лейкоцитов (лейкоцитарной формулы) и исследованием уровня тромбоцитов в крови для определения дальнейшей тактики ведения пациента и верификации диагноза [14].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: как правило, в дебюте ОМЛ, выявляется нормохромная, нормоцитарная анемия различной степени тяжести. Количество ретикулоцитов в пределах нормы или снижено. Примерно у 75% пациентов имеется тромбоцитопения. Средний уровень лейкоцитов на этапе установления диагноза около 15 x 10⁹/л. 20% пациентов имеют лейкоцитоз более 100 x 10⁹/л.

Подсчет лейкоцитарной формулы необходимо выполнять не на автоматическом анализаторе. Рекомендовано исследовать как минимум 200 лейкоцитов в мазке периферической крови.

- Рекомендуется всем пациентам при подозрении и при установленном ОМЛ, а также в ходе терапии с частотой от 1 - 3 раз в неделю до ежемесячного, выполнить анализ крови биохимический общетерапевтический (исследование уровня общего белка в крови, исследование уровня альбумина в крови и определение альбумин/глобулинового соотношения в крови, мочевина, креатинин, билирубин, АЛТ, АСТ, ЛДГ, магний, натрий, калий, общий кальций, глюкоза) для диагностики сопутствующей патологии (заболеваний) и определения тактики сопроводительной терапии [14].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

- Рекомендуется всем пациентам при подозрении и при установленном ОМЛ, а также в ходе терапии с частотой от 1 - 2 раз в неделю до ежемесячного выполнить коагулограмму (ориентировочное исследование системы гемостаза) (АЧТВ, протромбиновое время, протромбиновое время) для диагностики сопутствующей патологии и осложнений, а также определения тактики сопроводительной терапии [3, 14, 15].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

- Рекомендуется всем пациентам при подозрении и при установленном ОМЛ, а также в ходе терапии выполнить общий (клинический) анализ мочи с частотой от еженедельного до ежемесячного для диагностики сопутствующей патологии и определения тактики сопроводительной терапии [14, 16].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

- Рекомендуется всем пациентам при подозрении и при установленном ОМЛ, а также в ходе терапии с частотой 1 раз в 3 - 6 месяцев определение антител классов M, G (IgM, IgG) к вирусу иммунодефицита человека ВИЧ-1 (Human immunodeficiency virus HIV-1) в крови, и при необходимости молекулярно-биологическое исследование крови на вирус иммунодефицита человека ВИЧ-1 (Human immunodeficiency virus HIV-1) для уточнения необходимости одновременного проведения противоопухолевой и антиретровирусной терапии [3, 14, 17].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

- Рекомендуется всем пациентам при подозрении и при установленном ОМЛ, а также в ходе терапии с частотой 1 раз в 3 - 6 месяцев определение антигена (HbsAg) вируса гепатита B (Hepatitis B virus) в крови, определение антител к вирусу гепатита C (Hepatitis C virus) в крови, и, при необходимости, молекулярно-биологического исследования крови на вирус гепатита B (Hepatitis B virus) и на вирус гепатита C (Hepatitis C virus) с целью уточнения риска реактивации вирусного гепатита и, в случае необходимости, ее профилактики [3, 14, 18, 19]

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

- Рекомендуется всем пациентам при подозрении и при установленном ОМЛ, молекулярно-биологическое исследование крови на на вирус простого герпеса (Herpes simplex virus), на цитомегаловирус (Cytomegalovirus), на вирус Эпштейна-Барра (Epstein - Barr virus) с целью уточнения риска развития герпетической инфекции и, в случае необходимости, ее профилактики [3, 14, 20].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

- Рекомендуются всем пациентам при подозрении и при установленном ОМЛ микробиологическое (культуральное) исследование отделяемого из полости рта; исследование микробиоценоза кишечника культуральными методами; микробиологическое (культуральное) исследование крови на стерильность; микробиологическое (культуральное) исследование мочи на бактериальные патогены с целью проведения прецизионной антибиотической терапии в ходе лечения при наличии фебрильной лихорадки и инфекционных осложнений [3, 21, 22].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

- Рекомендуется всем пациентам при подозрении и при установленном ОМЛ, а также в случае развития рецидива и после выполнения алло-ТГСК, определение основных групп крови по системе AB0 и определение антигена D системы Резус (резус-фактор) для возможности выполнения заместительной гемокомпонентной терапии при наличии показаний до, во время или после терапии [3, 14, 23].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

- Рекомендуется всем пациентам выполнение цитологического исследования мазка костного мозга (миелограммы) при подозрении на ОЛ, а также пациентам с верифицированным ОМЛ в процессе лечения, после окончания программы индукции, консолидации, в ходе проведения поддерживающей терапии, перед выполнением ТГСК, после завершения всей запланированной программы лечения, а также при выявлении изменений в общем клиническом анализе крови вне связи с проводимым лечением и/или подозрении на рецидив ОМЛ. При констатации рецидива (независимо от процентного содержания бластных клеток в периферической крови) выполнить цитологическое и дополнительно цитохимическое исследование микропрепарата костного мозга (или отпечатков трепанобиоптата костного мозга, при невозможности получения аспирата) с морфологическим и цитохимическим исследованиями бластных клеток для подтверждения рецидива и идентификации клеточной дифференцировки [3, 14, 24, 25].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: получение цитологического препарата костного мозга путем пункции является обязательной рутинной диагностической процедурой. Процедура должна проводиться под наркозом!!!!

Мазки костного мозга исследуют с помощью окраски по Маю-Грюнвальду, Паппенгейму или Райту-Гимзе. Выполнение трепанбиопсии не является обязательным, за исключением ситуаций с так называемым "сухим проколом" или очень скудным пунктатом костного мозга. Рекомендовано исследовать как минимум 500 ядросодержащих клеток в мазке костного мозга.

Для установления диагноза ОМЛ в мазке периферической крови или костного мозга необходимо наличие 20% или более бластных клеток. При ОМЛ с t(15;17), t(8;21), inv(16) or t(16;16) и при некоторых случаях острого эритромиелоза доля бластных клеток может быть менее 20%. В соответствии с новой классификацией ВОЗ 2016 года процент бластных клеток подсчитывают вне зависимости от доли красного ростка.

Миелобласты, монобласты и мегакариобласты включают в общее число бластных клеток. В случаях ОМЛ с монобластной, моноцитарной и миеломоноцитарной дифференцировкой промоноциты (но не атипические/зрелые моноциты) также считают эквивалентами бластных клеток. Эритробласты не включают в общее число бластных клеток.

Для верификации диагноза истинного эритробластного лейкоза при подсчете пунктата костного мозга клетки эритроидного ряда должны составлять > 80% от всех клеток костного мозга, при этом проэритробласты должны быть 30%, без учета миелобластов. Проэритробласты, в соответствии с номенклатурой ВОЗ, - это незрелые эритрокариоциты, при этом, в соответствии с терминологией клеток эритропоэза по И.А. Кассирскому и Г.А. Алексееву, - это эритробласты и пронормобласты. При истинном эритробластном лейкозе дисмегакароцитопоэз встречается часто, в то время как дисгранулоцитопоэз - редко [26].

Выполнение цитохимического исследования микропрепарата костного мозга необходимо, даже если определяется высокое содержание бластных клеток в периферической крови. Это связано с тем, что в ряде случаев цитохимические реакции могут давать различные результаты в клетках периферической крови и костного мозга, что может повлечь за собой установление ошибочного диагноза. Диагноз основывают на результатах исследования, полученного на клетках костного мозга. Используют реакции на миелопероксидазу (myeloperoxidase - MPO) или судановый черный, неспецифическую эстеразу (альфа-нафтилацетатэстеразу, подавляемую или нет фторидом натрия) и PAS (Periodic Acid Schiff). Обнаружение миелопероксидазы в 3% и более бластных клеток указывает на миелоидную линию дифференцировки. В то же время ее отсутствие не исключает миелоидную направленность клеток, потому что в ранних миелобластах, а также монобластах, мегакариобластах и эритробластах МРО < 3% или не определяется. Окраска судановым черным аналогична МРО, но является менее специфичной. Неспецифическая эстераза имеет высокую диффузную или гранулярную цитоплазматическую активность (в зависимости от методики проведения реакции) в монобластах и промоноцитах, которая должна подавляться полностью или значительно фторидом натрия. PAS-реакция в миелобластах определяется в диффузном виде, в монобластах и промоноцитах - в диффузно-гранулярном, в эритробластах - в виде гранул или блоков. На основании морфоцитохимического исследования бластных клеток может быть диагностировано около 90% случаев ОМЛ, при отсутствии активности MPO и неспецифической эстеразы необходимо проведение иммунофенотипического исследования методом проточной цитофлюориметрии.

- Рекомендуется всем пациентам при первичной диагностике ОЛ, а также при обследовании по поводу диагностированного рецидива ОМЛ, выполнить иммунофенотипирование гемопоэтических клеток-предшественниц в костном мозге для определения принадлежности бластных клеток к той или иной линии клеточной дифференцировки [3, 6, 14, 27].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: Иммунофенотипирование выполняется всегда на клетках костного мозга, даже если определяется высокое содержание бластных клеток в периферической крови. Определение процента бластных клеток методом проточной цитофлуориметрии при первичной диагностике не является заменой морфологического подсчета, так как результаты этих двух исследований могут не совпадать [27].

Для подтверждения миелоидной направленности опухолевых клеток необходимо оценить экспрессию миелоидных антигенов. MPO - линейно-специфический маркер миелоидной линии, лизосомальный фермент гранулоцитов. К менее специфичным миелоид-ассоциированным антигенам относятся CD11b, CD11c, CD13, CD15, CD16, CD33, CD64, CD65, CD66b, лизоцим и другие. Диагноз ОМЛ может быть установлен и в том случае, если MPO не выявляется, а опухолевые клетки экспрессируют другие, менее специфичные миелоидные маркеры, и исключен лимфобластный вариант ОЛ.

Между морфоцитохимической классификацией ФАБ и иммунофенотипическими признаками нет четкой корреляции. Большинство миелоидных маркеров могут быть как позитивными, так и негативными при разных вариантах ОМЛ по ФАБ, за исключением специфических антигенов CD41а и CD61, которые характерны только для мегакариоцитарной/тромбоцитарной линии. Даже гликофорин A (CD235a), маркер эритроидной линии, может быть негативным при эритробластном лейкозе, если опухолевые клетки происходят из более ранних предшественников. Таким образом, по данным иммунофенотипического (ИФТ) исследования нельзя определять FAB-вариант ОМЛ.

Бластные клетки считаются позитивными по экспрессии мембранного антигена, если он определяется на 20% бластных клеток и более (пороговое значение). Для цитоплазматических маркеров (таких, как цитоплазматический CD3, MPO, лизоцим, ядерная TdT и другие) используют более низкий порог - 10%.

В случае получения невозможности получения аспирата костного мозга, выполняется иммуногистохимическое исследование трепанобиоптата костного мозга.

ИФТ выполняют с помощью мультипараметрической проточной цитофлюориметрии (обычно как минимум 3- или 4-цветной). В случае анализа трепанобиоптата выполняется его ИГХ исследование. Особенно ИФТ исследование необходимо для установления диагноза ОМЛ с минимальной дифференцировкой, острого мегакариоцитарного лейкоза и ОЛ с неопределенной дифференцировкой.

- Рекомендуется всем пациентам при первичной диагностике ОЛ а также при обследовании по поводу диагностированного рецидива ОМЛ, выполнить цитогенетическое исследование (кариотип) аспирата костного мозга с целью выявления аномалии кариотипа и стратификации пациентов по группам риска, а также для определения тактики лечения и выявления маркера для мониторинга динамики опухолевого клона на фоне терапии [3, 6, 14].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: стандартное цитогенетическое исследование является необходимым компонентом диагностических процедур у пациента с подозрением на ОЛ. Хромосомные аномалии выявляются примерно у половины пациентов ОМЛ. Семь транслокаций и инверсий (и их варианты) относятся ВОЗ в категорию "ОМЛ с устойчиво выявляемыми хромосомными аномалиями". Более того, обнаружение некоторых генетических аномалий при наличии 20% и более бластных клеток в костном мозге является достаточным для установления диагноза "ОМЛ с признаками миелодисплазии". Для определения кариотипа достоверным считается исследование как минимум 20 метафаз. Аномалии кариотипа могут устанавливаться и на основании исследования клеток периферической крови. Мониторинг выявленных при первичном исследовании аномалий кариотипа позволяет оценить полноту достигнутого эффекта терапии. Определение тех или иных цитогенетических аномалий уже на момент диагностики ОМЛ может определить терапевтическую тактику для конкретного пациента: например, выявление комплексных изменений кариотипа или моносомного кариотипа свидетельствует о необходимости применения отличного от стандартного цитостатического воздействия и обязательного обсуждения вопроса о возможности предельно раннего включения алло-ТГСК в программу лечения ОМЛ, вплоть до проведения алло-ТГСК в аплазии после первого индукционного курса.

- Рекомендуется всем пациентам при первичной диагностике ОЛ, а также при обследовании по поводу диагностированного рецидива ОМЛ, выполнить молекулярно-генетическое исследование - молекулярно-генетическое исследование мутаций в гене RUNX1-RUNX1T1 методом ПЦР, молекулярно-генетическое исследование мутаций в гене CBFB-MYH11 методом ПЦР и молекулярно-генетическое исследование мутаций в гене FLT3-TKI методом секвенирования в аспирате костного мозга для стратификации пациентов по группам риска и определения тактики лечения, а также с целью выявления маркера для мониторинга динамики опухолевого клона на фоне терапии [3, 14, 25].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: тестирование мутаций NPM1, CEBPA и FLT3 является желательным, поскольку современные подходы к лечению ОМЛ предполагают наличие информации об этих мутациях, так как это может влиять на определение терапевтической тактики. ОМЛ с мутациями в генах NPM1 или CEBPA определены ВОЗ как условные категории. Экспрессия генов ERG, MN1, EVI1, BAALC, мутации генов WT1, RUNX1, MLL, KITRAS, TP53, TET2, IDH1 и определение МОБ исследуются в рамках КИ. Молекулярный скрининг на указанные маркеры самостоятельного значения не имеет, но как вспомогательный метод может быть использован при отсутствии результатов стандартного цитогенетического исследования. В современной молекулярной диагностике ОМЛ широко применяется и метод секвенирования нового поколения, созданы так называемые диагностические панели из нескольких десятков генов, вовлеченных в патогенез ОМЛ, которые позволяют четко отнести исследуемый ОМЛ к той или иной категории риска.

- Рекомендуется всем пациентам при первичной диагностике ОЛ, а также при обследовании по поводу диагностированного рецидива ОМЛ, которым не выполнено цитогенетическое исследование (кариотип) аспирата костного мозга (мало материала, не было получено митозов или получено менее 20 митозов) или получен нормальный кариотип, но при этом выявляются яркие клинико-лабораторные симптомы, характерных для определенных вариантов ОМЛ, выполнить молекулярно-цитогенетическое исследование (FISH-метод) для детекции реарранжировок генов в аспирате костного мозга с целью выявления маркера для мониторинга динамики опухолевого клона на фоне терапии [3, 14, 25].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: при ОМЛ исследуются RUNX1-RUNX1T1, CBFB-MYH11, PML/RARA, MLL и EVI1 или потеря хромосомы 5q и 7. FISH зачастую необходим для идентификации слияний MLL при транслокациях региона 11q23. Возможно также проведение FISH на морфологических и гистологических препаратах костного мозга.

- Рекомендуется всем пациентам, у которых имеется информация о наличии молекулярного маркера или известен аберрантный иммунофенотип (выявленные на момент диагностики ОМЛ), иммунофенотипирование биологического материала для выявления маркеров минимальной остаточной болезни при гемобластозах (для группы промежуточного прогноза) или молекулярно-генетическое исследование минимальной остаточной болезни при лейкозах при помощи пациент-специфичных праймеров (для группы благоприятного прогноза) для контроля за лечением и определения тактики постиндукционной терапии [3, 14, 28, 29].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: для подтверждения полноты достигнутого ответа на терапию и его сохранение, в соответствии с современными международными рекомендациями, необходимо выполнять в контрольные точки оценку МОБ методом проточной цитофлюорометрии (аберрантный иммунофенотип), а для группы благоприятного прогноза - только молекулярное исследование МОБ методом ПЦР (количественная оценка экспрессии генов RUNX1-RUNX1T1, CBFB-MYH1, NPM1) [29, 30].

По результатам исследований, проводимых Российской группой по терапии острых лейкозов, - при достижении МОБ-негативной ремиссии после 1-го курса терапии у пациентов из группы промежуточного прогноза, при выполнении дальнейшего тщательного мониторинга МОБ, возможно рассмотрение вопроса о продолжении ХТ без выполнения алло-ТГСК. У пациентов из группы благоприятного прогноза динамика химерного транскрипта также определяет целесообразность выполнения пациентам алло-ТГСК [31].

- Рекомендуется всем пациентам выполнить спинномозговую пункцию с общим (клиническим) анализом спинномозговой жидкости с целью диагностики нейролейкемии и нейропрофилактики [3, 14, 25].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5).

Комментарии: при ОМЛ в целом вовлечение ЦНС встречается менее чем у 5% пациентов, при ряде вариантов ОМЛ, особенно с моноцитарной дифференцировкой, вероятность вовлечения в процесс оболочек головного мозга выше.

Желательно поддерживать число тромбоцитов в крови перед выполнением спинномозговой пункции 30 x 10⁹/л и выше. Если уровень тромбоцитов не удается повысить до 30 x 10⁹/л и выше, при отсутствии клинических признаков поражения ЦНС, от пункции можно воздержаться до повышения тромбоцитов в гемограмме выше 30 x 10⁹/л.

Если у пациента определяется лейкоцитоз выше 100 x 10⁹/л в крови, то первую спинномозговую пункцию следует отложить до редукции числа лейкоцитов менее 20 x 10⁹/л.

- Рекомендуется всем пациентам выделять первичную ДНК или РНК из клеток костного мозга и сохранять ее в биобанке либо направлять материал на хранение в лаборатории Федеральных Центров для возможности последующего выполнения молекулярных исследований [3, 14, 25].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: сохранение первичного биологического материала осуществляется в виде ДНК и/или РНК, выделенных из костномозговых клеток или замороженных клеток. Материал может в последующем понадобиться для проведения молекулярных исследований, позволяющих определить группы риска, а также в рамках клинических исследований (КИ).