2.5 Иные диагностические исследования

- Рекомендуется всем пациентам с подозрением на НБ получение цитологического препарата костного мозга путем пункции из 4-х точек и цитологическое исследование мазка костного мозга (миелограмма), детям старше 12 мес. дополнительно осуществляется - получение гистологического препарата костного мозга (трепанобиопсия) из 2-х точек, патолого-анатомическое исследование биопсийного (операционного) материала костного мозга с применением иммуногистохимических методов для выявления/исключения наличия атипичных клеток и определения стадии заболевания [2, 11, 13].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств 5)

Комментарии: поражение костного мозга при НБ является очаговым. В связи с этим пункция костного мозга из одной точки не является приемлемой. Требуется выполнение костномозговых пункций как минимум из 4 различных точек. Дополнительно детям старше 12 мес. должна быть выполнена трепанобиопсия из 2-х точек. Целесообразно в случае выполнения пункции костного мозга приготавливать по 10 стекол из каждой точки. Таким образом, при выполнении пункции костного мозга из 4 точек общее число стекол составит 40. Трепанобиопсия не проводится детям первого года жизни.

Дополнительно оценка поражения костного мозга по данным миелограммы и трепанобиопсии проводится на этапах терапии и при динамическом наблюдении в случае подозрения на прогрессию заболевания.

- Рекомендуется всем пациентам с подозрением на НБ, у которых при проведении хирургического удаления образования или биопсии/трепанобиопсии опухоли был получен биопсийный материал, выполнение патолого-анатомического исследования биопсийного (операционного) материала [2, 11, 13].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств 5)

Комментарии: после проведения комплексного обследования в рамках ранее описанного алгоритма все пациенты рассматриваются как кандидаты на выполнение инициального хирургического вмешательства, объем которого определяется после совместного обсуждения врачом - детским онкологом, врачом-хирургом, врачом ультразвуковой диагностики и врачом-рентгенологом. При проведении предоперационного планирования оценивается топография первичной опухоли и ее взаимосвязь с жизненно важными структурами (магистральными сосудами, паренхиматозными органами и т.д.), определяются факторы хирургического риска по данным визуализации - IDRF.

Пациенты с локализованной опухолью до 7 см в забрюшинной области и до 9 см в заднем средостении при отсутствии факторов хирургического риска, а именно при отсутствии тотального вовлечения магистральной артерии в опухоль и сохранении просвета магистральной вены могут быть претендентами на малоинвазивное хирургическое лечение. Полная резекция показана только в том случае, если предполагаемый риск развития послеоперационных осложнений является низким. Операция не должна носить калечащий характер (например, нефрэктомия). Если предполагаемый риск осложнений является высоким, то допустимо проведение частичной резекции опухоли или только биопсии.

Выполнение малоинвазивных хирургических вмешательств должно проводиться в центрах, имеющих опыт выполнения таких операций, и при наличии специального оборудования.

Биопсия метастазов.

В ряде случаев возможно проведение биопсии метастатических очагов. Например, биопсия подкожных метастазов, печени при 4S стадии НБ, биопсия метастатически пораженных отдаленных лимфатических узлов и т.д.

Патолого-анатомическое исследование является основным методом окончательной верификации диагноза у пациентов с НБ. В заключении должен быть указан вариант нейрогенной опухоли по Международной гистологической классификации нейрогенных опухолей (International Neuroblastoma Pathology Classification) [20].

Гистология опухоли и молекулярно-генетическое исследование являются критическими для стратификации пациентов с локализованными формами нейробластомы, при 4S стадии и при 4-й стадии у детей первого года жизни. Поэтому биопсия опухоли всегда требуется при локализованных формах заболевания.

В случае 4-й стадии заболевания статус MYCN и хромосомы 1p могут быть оценены в костном мозге при условии, если поражение опухолевыми клетками превышает 60%. Определение других параметров (например, опухоль-ассоциированных антигенов) невозможно при использовании проб костного мозга. Поэтому открытая биопсия для получения опухолевой ткани рекомендуется даже пациентам с 4-й стадией заболевания.

Детский онколог должен контролировать сбор опухолевого материала. Тесное сотрудничество между детским онкологом и патологоанатомом является предпосылкой для получения и отправки достаточного объема опухолевой ткани. Обработка и разделение опухолевой ткани должно быть выполнено патологом в региональной лаборатории. Ткань опухоли должна быть доставлена из операционной в лабораторию патоморфологии незамедлительно и обработана в течение 30 мин. При наличии возможности криоконсервации образца ткани (наличие жидкого азота для шоковой заморозки и низкотемпературного хранилища с температурой хранения образцов не выше -80 C°) врач-патологоанатом может разделить образец на фрагмент (фрагменты), необходимые для диагностики, и фрагмент ткани для криоконсервации с целью последующего молекулярно-генетического исследования. Патолог решает, какую часть опухоли можно заморозить без ущерба для диагностики. Если возможно, он должен собрать материал как минимум из 2 макроскопически различных областей (если они присутствуют). Ткань, направленная на криоконсервацию, должна быть разделена на фрагменты, не превосходящие по массе 50 мг или по линейным размерам 3'3'3 мм. По одному фрагменту ткани помещается в криопробирку (пробирка объемом 1,5 - 2 мл с резьбовой крышкой с резиновым уплотнением), которая должна быть промаркирована (с указанием паспортных данных пациента, даты и времени криоконсервации, а также этапа взятия биоматериала (первичная диагностика, операция "второго просмотра", биопсия при верификации рецидива) и незамедлительно погружена в жидкий азот (объемом 200 - 500 мл). После полного испарения жидкого азота пробирка перемещается в морозильную камеру (температура не выше -80 C°). Не допускается криоконсервация ткани в морозильной камере бытового холодильника!

Отпечатки опухоли должны быть выполнены до помещения материала в формалин. В дополнение периферическая кровь должна быть собрана для выполнения молекулярного анализа.

Оставшаяся после криоконсервации ткань или вся ткань опухоли, если криоконсервация невозможна, фиксируется в буферном 4% формалине для гистологического исследования. Множественные блоки из макроскопически разных областей опухоли, особенно опухолевые узлы, должны быть собраны. Участки некрозов и регрессирующая опухолевая ткань должны быть собраны в соответствии с отношением их объема к объему всей опухоли, что позволит правильно установить степень регрессии.

Патолог в локальной патоморфологической лаборатории должен классифицировать опухоль в соответствии с Международной гистологической классификацией нейрогенных опухолей (International Neuroblastoma Pathology Classification), включая оценку индекса митоз-кариорексис. Оценены должны быть также степень регрессии и дифференцировки и вовлеченность краев резекции. В зависимости от степени дифференцировки, индекса митоз-кариорексис и возраста пациента опухоли делятся на благоприятный и неблагоприятный типы.

После химиотерапии опухоль должна быть классифицирована в соответствии с упомянутой схемой с указанием в протоколе гистологического исследования, была или нет проведена предоперационная химиотерапия с оценкой степени посттерапевтического патоморфоза.

- Рекомендуется всем пациентам с гистологически подтвержденным диагнозом НБ - молекулярно-генетическое исследование мутаций MYCN в биопсийном (операционном) материале и определение амплификации гена MYCN в биопсийном (операционном) материале методом флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) для определения группы риска [2, 11, 13].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств 5)

Комментарии: оценка молекулярно-генетических маркеров является обязательным диагностическим тестом у пациентов с НБ.

Обычно принадлежность к группе риска определяется по присутствию MYCN, делеции и дисбаланса 1p или потере гетерозиготности по локусу 1p. Отсутствие MYCN-амплификации, делеции или дисбаланса 1p, гетерозиготность по локусу 1p являются критериями "нормального" риска.

Для терапевтической стратификации статусы онкогена MYCN и дистальной части хромосомы 1p (1p36) целесообразно оценивать с использованием следующих методик следующих методик: флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) и полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Критерии статуса MYCN, 1p по данным FISH

Амплификация гена MYCN определяется при 4-кратном увеличении и более числа копий гена MYCN в сравнении с числом хромосом 2 (контрольный регион для определения количества хромосом 2 - центромера хромосомы 2).

Понятие "гейн MYCN" (Gain MYCN - наличие дополнительных копий) определяется при соотношении числа копий гена MYCN к контрольному региону хромосомы 2 от 1,5 до 4.

Делеция региона 1p определяется при наличии одного сигнала от соответствующего региона 1p36 в 33% исследуемых ядер и более. Имбаланс по региону 1p определялся при преобладании сигналов от контрольного региона 1(q25) над количеством сигналов от региона 1(p36).

Критерии статуса MYCN, 1p по данным ПЦР

Для оценки статуса MYCN проводится количественная ПЦР в режиме реального времени с детекцией фрагментов гена MYCN и референсного гена (например, POLR2D или NAGK). Количество копий гена MYCN рассчитывается по формуле:

N = 2^{- (Cq MYCN - Cq РГ)} x 2,

где N - количество копий гена MYCN, CqMYCN - величина порогового цикла ПЦР для гена MYCN, CqРГ - величина порогового цикла ПЦР для референсного гена. Величина 2 свидетельствует о нормальном количестве копий (равном 2); 3 - 9 - увеличение количества копий, не достигающее порога амплификации (gain). Может наблюдаться при три- и тетраплоидном наборе хромосом, для уточнения необходимо исследование методом FISH; 10 - амплификация гена MYCN.

Определение статуса 1p проводится методом стандартной ПЦР с детекцией микросателлитных повторов в области короткого плеча хромосомы 1 (D1S2697, D1S436, D1S214, D1S2663, D1S80, D1S76). Необходим параллельный анализ ткани опухоли и конституционального материала (ДНК из лейкоцитов периферической крови или клеток буккального эпителия). В случае обнаружения двух ПЦР-продуктов для каждого локуса в опухолевом и конституциональном материале определяется гетерозиготное (нормальное) состояние короткого плеча хромосомы 1. Если выявляется по одному ПЦР-продукту - гомозиготное состояние, анализ по данному локусу неинформативен. В случае выявления одного ПЦР-продукта при анализе ДНК из ткани опухоли и двух продуктов при исследовании конституциональной ДНК - потеря гетерозиготности, сопровождающая делецию 1p.

Наиболее часто делеция затрагивает дистально расположенные локусы: D1S436, D1S80, D1S76.

- Рекомендуется использовать мультидисциплинарный подход к диагностике и ведению пациентов с НБ на этапах лечения с привлечением на консультацию следующих специалистов для исключения сопутствующей патологии, выбора тактики ведения для обсуждения и разработки ранних подходов к реабилитации [2, 13, 14]:

- детский онколог (гематолог);

- врач-невролог;

- врач-офтальмолог;

- врач - детский хирург;

- анестезиолог/реаниматолог и иных врачей-специалистов.

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств 5)