2.3. Лабораторные диагностические исследования

Перечень тестов и исследований, необходимых для диагностики и верификации диагноза ОМЛ, приведен в Приложении А3.1. На основании клинической картины, а также анализа результатов перечисленных исследований пациентов стратифицируют на молекулярно-генетические, а также клинические группы прогноза (см. Приложения Г1 и Г2).

- Рекомендуется всем пациентам при подозрении, диагностике ОМЛ, а также в ходе терапии с частотой от ежедневного до ежемесячного выполнение общего (клинического) анализа крови развернутого с подсчетом лейкоцитарной формулы и определением числа тромбоцитов для определения дальнейшей тактики ведения пациента и верификации диагноза [1, 2, 7, 8, 17].

Уровень убедительности рекомендаций - C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарий: как правило, в дебюте ОМЛ выявляется нормохромная, нормоцитарная анемия различной степени тяжести. Количество ретикулоцитов в пределах нормы или снижено. Примерно у 75% пациентов имеется тромбоцитопения. Средний уровень лейкоцитов на этапе установления диагноза составляет около 15 ' 10⁹/л; 20% пациентов имеют лейкоцитоз > 100 ' 10⁹/л.

Подсчет лейкоцитарной формулы необходимо выполнять не на автоматическом анализаторе. Рекомендовано исследовать как минимум 200 лейкоцитов в мазке периферической крови.

- Рекомендуется всем пациентам при подозрении и при установленном ОМЛ, а также в ходе терапии с частотой от 1 - 3 раз в неделю до ежемесячного выполнить анализ крови биохимический общетерапевтический (общий белок, белковые фракции, мочевина, креатинин, билирубин, аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, лактатдегидрогеназа, магний, натрий, калий, кальций, глюкоза) для диагностики сопутствующей патологии (заболеваний) и определения тактики сопроводительной терапии [1, 2, 7, 8, 17].

Уровень убедительности рекомендаций - C (уровень достоверности доказательств - 5)

- Рекомендуется всем пациентам при подозрении и при установленном ОМЛ, а также в ходе терапии с частотой от 1 - 2 раз в неделю до ежемесячного выполнять коагулограмму (ориентировочное исследование системы гемостаза) (активированное частичное тромбопластиновое время, протромбиновое (тромбопластиновое) время в крови или в плазме, тромбиновое время в крови, исследование уровня фибриноген в крови) для диагностики сопутствующей патологии и осложнений, а также определения тактики сопроводительной терапии [1, 7, 18].

Уровень убедительности рекомендаций - C (уровень достоверности доказательств - 5)

- Рекомендуется всем пациентам при подозрении и при установленном ОМЛ, а также в ходе терапии выполнять общий (клинический) анализ мочи с частотой от еженедельного до ежемесячного для диагностики сопутствующей патологии и определения тактики сопроводительной терапии [1, 7, 19].

Уровень убедительности рекомендаций - C (уровень достоверности доказательств - 5)

- Рекомендуется всем пациентам при подозрении и при установленном ОМЛ, а также в ходе терапии с частотой 1 раз в 3 - 6 месяцев определение антител классов M, G (IgM, IgG) к вирусу иммунодефицита человека ВИЧ-1 (Human immunodeficiency virus HIV 1) в крови; определение антител классов M, G (IgM, IgG) к вирусу иммунодефицита человека ВИЧ-2 (Human immunodeficiency virus HIV 2) в крови для уточнения необходимости одновременного проведения противоопухолевой и антиретровирусной терапии [1, 7, 20].

Уровень убедительности рекомендаций - C (уровень достоверности доказательств - 5)

- Рекомендуется всем пациентам при подозрении и при установленном ОМЛ, а также в ходе терапии с частотой 1 раз в 3 - 6 месяцев выполнять определение антигена (HbsAg) вируса гепатита B (Hepatitis B virus) в крови и антигена вируса гепатита C (Hepatitis C virus) в крови и, при необходимости, молекулярно-биологическое исследование крови на вирус гепатита B (Hepatitis B virus) и гепатита C (Hepatitis C virus) в целях уточнения риска реактивации вирусного гепатита и, в случае необходимости, ее профилактики [1, 7, 21, 22].

Уровень убедительности рекомендаций - C (уровень достоверности доказательств - 5)

- Рекомендуется всем пациентам при подозрении и при установленном ОМЛ выполнение молекулярно-биологическое исследование крови на вирусы простого герпеса (Herpes simplex virus), цитомегаловирус (Cytomegalovirus), Эпштейна-Барра (Epstein-Barr virus) в целях уточнения риска развития герпетической инфекции и, в случае необходимости, ее профилактики [1, 23 - 26].

Уровень убедительности рекомендаций - C (уровень достоверности доказательств - 4)

- Рекомендуются всем пациентам при подозрении и при установленном ОМЛ выполнять микробиологическое (культуральное) исследование в целях проведения прецизионной антибиотической терапии в ходе лечения при возникновении фебрильной лихорадки и инфекционных осложнений [1, 2, 27, 28].

Уровень убедительности рекомендаций - C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: может проводиться микробиологическое (культуральное) исследование (дисбактериоз) с применением автоматизированного посева, микробиологическое (культуральное) исследование отделяемого из полости рта, микробиоценоза кишечника культуральными методами, крови на стерильность, мочи на бактериальные патогены.

- Рекомендуется всем пациентам при подозрении и при установленном ОМЛ, а также в случае развития рецидива и после выполнения алло-ТГСК определение основных групп крови по системе AB0, определение антигена D системы Резус (резус-фактор) для возможности проведения заместительной гемокомпонентной терапии при наличии показаний до, во время или после терапии [1, 29].

Уровень убедительности рекомендаций - C (уровень достоверности доказательств - 5)

- Рекомендуется всем пациентам получение цитологического препарата костного мозга путем пункции и цитологическое исследование мазка костного мозга (миелограмма) при подозрении на ОМЛ, а также пациентам с верифицированным ОМЛ в процессе лечения, после окончания программы индукции, консолидации, в ходе проведения поддерживающей терапии (1 раз в 3 месяца), перед выполнением ТГСК, после завершения всей запланированной программы лечения, а также при выявлении изменений в гемограмме вне связи с проводимым лечением и/или подозрении на рецидив ОМЛ [1, 7, 17].

Уровень убедительности рекомендаций - C (уровень достоверности доказательств - 5)

- Рекомендуется при констатации рецидива (независимо от процентного содержания бластных клеток в периферической крови) получение цитологического препарата костного мозга путем пункции и цитологическое исследование мазка костного мозга (миелограмма) и цитохимическое исследование микропрепарата костного мозга, или, при невозможности получения аспирата, получение гистологического препарата костного мозга и цитологическое и иммуноцитохимическое исследование отпечатков трепанобиоптата костного мозга для подтверждения рецидива и идентификации клеточной дифференцировки [1, 7, 17].

Уровень убедительности рекомендаций - C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарий: пункционное исследование (аспирация) костного мозга является обязательной рутинной диагностической процедурой. Мазки костного мозга исследуют с помощью окраски по Маю-Грюнвальду, Паппенгейму или Райту-Гимзе. Выполнение трепанобиопсии не является обязательным, за исключением ситуаций с так называемым "сухим проколом" или очень скудным пунктатом костного мозга. Рекомендовано исследовать как минимум 500 ядросодержащих клеток в мазке костного мозга.

Для установления диагноза ОМЛ в мазке периферической крови или костного мозга необходимо наличие 20% бластных клеток и более. При ОМЛ с t(15;17), t(8;21), inv(16) или t(16;16) и при некоторых случаях острого эритромиелоза доля бластных клеток может быть менее 20%. В соответствии с новой классификацией ВОЗ (2016) процент бластных клеток подсчитывают вне зависимости от доли красного ростка.

Миелобласты, монобласты и мегакариобласты включают в общее число бластных клеток. В случаях ОМЛ с монобластной, моноцитарной и миеломоноцитарной дифференцировкой промоноциты (но не атипические/зрелые моноциты) также считают эквивалентами бластных клеток. Эритробласты не включают в общее число бластных клеток.

Для верификации диагноза истинного эритробластного лейкоза при подсчете пунктата костного мозга клетки эритроидного ряда должны составлять > 80% от всех клеток костного мозга, при этом проэритробласты должны быть 30%, без учета миелобластов. В соответствии с номенклатурой ВОЗ проэритробласты - незрелые эритрокариоциты, при этом, в соответствии с терминологией клеток эритропоэза по И.А. Кассирскому и Г.А. Алексееву, - это эритробласты и пронормобласты. При истинном эритробластном лейкозе дисмегакароцитопоэз встречается часто, в то время как дисгранулоцитопоэз - редко. При разведении пунктата костного мозга периферической кровью и количестве клеток красного ряда менее 80% его оценка может проводиться по трепанобиоптату [30].

Выполнение цитохимического анализа клеток костного мозга необходимо, даже если определяется высокое содержание бластных клеток в периферической крови. Это связано с тем, что в ряде случаев цитохимические реакции могут давать различные результаты в клетках периферической крови и костного мозга, что может повлечь за собой установление ошибочного диагноза. Диагноз основывают на результатах исследования, полученного на клетках костного мозга. Используют реакции на миелопероксидазу (myeloperoxidase, MPO) или судановый черный, неспецифическую эстеразу (альфа-нафтилацетатэстеразу, подавляемую или нет фторидом натрия) и PAS (Periodic Acid Schiff - шифф-йодную кислоту). Обнаружение MPO в 3% бластных клеток и более указывает на миелоидную линию дифференцировки. В то же время ее отсутствие не исключает миелоидную направленность клеток, потому что в ранних миелобластах, а также монобластах, мегакариобластах и эритробластах MPO < 3% или не определяется. Окраска судановым черным аналогична MPO, но является менее специфичной. Неспецифическая эстераза имеет высокую диффузную или гранулярную цитоплазматическую активность (в зависимости от методики проведения реакции) в монобластах и промоноцитах, которая должна подавляться полностью или значительно фторидом натрия. PAS-реакция в миелобластах определяется в диффузном виде, в монобластах и промоноцитах - в диффузно-гранулярном, в эритробластах - в виде гранул или блоков. На основании морфоцитохимического исследования бластных клеток может быть диагностировано около 90% случаев ОМЛ, при отсутствии активности MPO и неспецифической эстеразы необходимо проведение иммунофенотипического (ИФТ) исследования методом проточной цитофлуориметрии.

- Рекомендуется всем пациентам при первичной диагностике ОЛ, а также при обследовании по поводу диагностированного рецидива ОМЛ выполнять иммунофенотипирование гемопоэтических клеток-предшественниц в костном мозге (ИФТ-исследование) в костном мозге для определения принадлежности бластных клеток к той или иной линии клеточной дифференцировки [1, 2, 4, 7, 8, 31].

Уровень убедительности рекомендаций - C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарий: ИФТ-исследование выполняется всегда на клетках костного мозга, даже если определяется высокое содержание бластных клеток в периферической крови. Определение процента бластных клеток методом проточной цитофлуориметрии при первичной диагностике не является заменой морфологического подсчета, так как результаты этих двух исследований могут не совпадать [31].

Для подтверждения миелоидной направленности опухолевых клеток необходимо оценить экспрессию миелоидных антигенов. MPO - линейно-специфический маркер миелоидной линии, лизосомальный фермент гранулоцитов. К менее специфичным миелоидассоциированным антигенам относятся CD11b, CD11c, CD13, CD15, CD16, CD33, CD64, CD65, CD66b, лизоцим и др. Диагноз ОМЛ может быть установлен и в том случае, если MPO не выявляется, а опухолевые клетки экспрессируют другие, менее специфичные миелоидные маркеры, и исключен лимфобластный вариант ОЛ.

Между морфоцитохимической классификацией французско-американско-британской (FAB) и ИФТ-признаками нет четкой корреляции. Большинство миелоидных маркеров могут быть как положительными, так и отрицательными при разных вариантах ОМЛ по FAB-классификации, за исключением специфических антигенов CD41a и CD61, которые характерны только для мегакариоцитарной/тромбоцитарной линии. Даже гликофорин A (CD235a), маркер эритроидной линии, может быть отрицательным при эритробластном лейкозе, если опухолевые клетки происходят из более ранних предшественников. Таким образом, по данным ИФТ-исследования нельзя определять FAB-вариант ОМЛ.

Бластные клетки считаются положительными по экспрессии мембранного антигена, если он определяется на 20% бластных клеток и более (пороговое значение). Для цитоплазматических маркеров (таких как цитоплазматический CD3, MPO, лизоцим, ядерная TdT и др.) используют более низкий порог - 10%.

В случае невозможности получения аспирата костного мозга выполняется иммуногистохимическое исследование трепанобиоптата костного мозга.

Иммунологические маркеры, характерные для разных морфоцитохимических вариантов ОМЛ, представлены в Приложении А3.4. ИФТ-исследование выполняют с помощью мультипараметрической проточной цитофлуориметрии (обычно как минимум 3- или 4-цветной). В случае анализа трепанобиоптата выполняется его иммуногистохимическое исследование. Особенно ИФТ-исследование необходимо для установления диагноза ОМЛ с минимальной дифференцировкой, острого мегакариоцитарного лейкоза и ОЛ с неопределенной дифференцировкой. ОЛ неясной линейности являются редкими типами лейкозов и включают случаи, которые не имеют признаков принадлежности к какой-либо клеточной линии (острый недифференцированный лейкоз) или такие случаи, бластные клетки которых экспрессируют маркеры более чем одной линии дифференцировки. В классификации Европейской группы по иммунологическому описанию лейкозов (EGIL) ОЛСФ подразделяют на острый бифенотипический лейкоз, когда одна опухолевая популяция экспрессирует антигены нескольких линий дифференцировки, и острый билинейный лейкоз, при котором существуют 2 и более популяции бластных клеток разной линейности. В классификации ВОЗ эти варианты объединены в ОЛСФ. Для достоверной диагностики ОЛСФ в классификации ВОЗ предусмотрены следующие критерии, описанные в Приложении А3.5.

- Рекомендуется всем пациентам при первичной диагностике ОЛ, а также при обследовании по поводу диагностированного рецидива ОМЛ выполнить цитогенетическое исследование (кариотип) аспирата костного мозга в целях выявления аномалии кариотипа и стратификации пациентов по группам риска, а также для определения тактики лечения и выявления маркера для мониторинга динамики опухолевого клона на фоне терапии [1, 2, 4, 7, 8].

Уровень убедительности рекомендаций - C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарий: стандартное цитогенетическое исследование является необходимым компонентом диагностических процедур у пациента с подозрением на ОЛ. Хромосомные аномалии выявляются примерно у половины пациентов с ОМЛ. Семь транслокаций и инверсий (и их варианты) относятся ВОЗ в категорию "ОМЛ с устойчиво выявляемыми хромосомными аномалиями". Более того, обнаружение некоторых генетических аномалий при наличии 20% бластных клеток и более в костном мозге является достаточным для установления диагноза "ОМЛ с признаками миелодисплазии". Для определения кариотипа достоверным считается исследование как минимум 20 метафаз. Аномалии кариотипа могут устанавливаться и на основании исследования клеток периферической крови. Мониторинг выявленных при первичном исследовании аномалий кариотипа позволяет оценить полноту достигнутого эффекта терапии. Определение тех или иных цитогенетических аномалий уже на момент диагностики ОМЛ может определить терапевтическую тактику для конкретного пациента, например выявление комплексных изменений кариотипа или моносомного кариотипа свидетельствует о необходимости применения отличного от стандартного цитостатического воздействия и обязательного обсуждения вопроса о возможности предельно раннего включения алло-ТГСК в программу лечения ОМЛ, вплоть до проведения алло-ТГСК в аплазии после 1-го индукционного курса.

- Рекомендуется всем пациентам при первичной диагностике ОЛ, а также при обследовании по поводу диагностированного рецидива ОМЛ, выполнить молекулярно-генетические исследования мутаций в гене RUNX1-RUNX1T1 методом ПЦР, мутаций в гене CBFB-MYH11 методом ПЦР и мутаций в гене FLT3-TKI методом секвенирования в аспирате костного мозга для стратификации пациентов по группам риска и определения тактики лечения, а также в целях выявления маркера для мониторинга динамики опухолевого клона на фоне терапии [1, 7, 8].

Уровень убедительности рекомендаций - C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарий: Молекулярно-генетические исследования мутаций в генах NPM1, CEBPA методом секвенирования, CEBPA и FLT3-TKI являются желательным, поскольку современные подходы к лечению ОМЛ предполагают наличие информации об этих мутациях, так как это может влиять на определение терапевтической тактики. ОМЛ с мутациями в генах NPM1 или CEBPA определены ВОЗ как условные категории. Экспрессия генов ERG, MN1, EVI1, BAALC, мутации генов WT1, RUNX1, MLL, KITRAS, TP53, TET2, IDH1 и определение МОБ исследуются в рамках клинических исследований. Молекулярный скрининг на указанные маркеры самостоятельного значения не имеет, но как вспомогательный метод может быть использован при отсутствии результатов стандартного цитогенетического исследования. В современной молекулярной диагностике ОМЛ широко применяется и метод секвенирования нового поколения, созданы так называемые диагностические панели из нескольких десятков генов, вовлеченных в патогенез ОМЛ, которые позволяют четко отнести исследуемый ОМЛ к той или иной категории риска.

- Рекомендуется всем пациентам при первичной диагностике ОМЛ, а также при обследовании по поводу диагностированного рецидива ОМЛ, которым не выполнено стандартное цитогенетическое исследование (мало материала, не было получено митозов или получено менее 20 митозов) или у которых получен нормальный кариотип, но при этом выявляются яркие клинико-лабораторные симптомы, характерные для определенных вариантов ОМЛ, провести патолого-анатомическое исследование биопсийного (операционного) материала тканей костного мозга с применением метода флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) на одну пару хромосом для детекции реаранжировок генов в аспирате костного мозга в целях выявления маркера для мониторинга динамики опухолевого клона на фоне терапии [1, 7, 8].

Уровень убедительности рекомендаций - C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарий: при ОМЛ исследуются RUNX1-RUNX1T1, CBFB-MYH11, PML/RARA, MLL и EVI1 или потеря хромосом 5q и 7. FISH зачастую необходим для идентификации слияний MLL при транслокациях региона 11q23. Возможно также проведение FISH на морфологических и гистологических препаратах костного мозга.

- Рекомендуется всем пациентам, у которых имеется информация о наличии молекулярного маркера или известен аберрантный иммунофенотип (выявленные на момент диагностики ОМЛ), ИФТ-исследование биологического материала для выявления маркеров МОБ при гемобластозах (для группы промежуточного прогноза) или молекулярно-генетическое исследование МОБ при лейкозах при помощи пациент-специфичных праймеров (для группы благоприятного прогноза) для контроля за лечением и определения тактики постиндукционной терапии [1, 2, 7, 8, 32].

Уровень убедительности рекомендаций - C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарий: для подтверждения полноты достигнутого ответа на терапию и его сохранение, в соответствии с современными международными рекомендациями, необходимо выполнять в контрольные точки оценку МОБ методом проточной цитофлуорометрии (аберрантный иммунофенотип), а для группы благоприятного прогноза - только молекулярное исследование МОБ методом ПЦР (количественная оценка экспрессии генов RUNX1-RUNX1T1, CBFB-MYH1, NPM1) [32, 33].

По результатам исследований, проводимых российской группой по терапии ОЛ, при достижении МОБ-негативной ремиссии после 1-го курса терапии у пациентов из группы промежуточного прогноза при выполнении дальнейшего тщательного мониторинга МОБ возможно рассмотрение вопроса о продолжении ХТ без проведения алло-ТГСК. У пациентов из группы благоприятного прогноза динамика химерного транскрипта также определяет целесообразность выполнения пациентам алло-ТГСК [34].

- Рекомендуется всем пациентам выполнить спинномозговую пункцию с серологическим исследованием ликвора в целях диагностики нейролейкемии и нейропрофилактики [1, 2, 7, 8, 35].

Уровень убедительности рекомендаций - C (уровень достоверности доказательств - 4)

Комментарий: при ОМЛ в целом вовлечение центральной нервной системы встречается менее чем у 5% пациентов, при ряде вариантов ОМЛ, особенно с моноцитарной дифференцировкой, вероятность вовлечения в процесс оболочек головного мозга выше.

Желательно поддерживать число тромбоцитов перед выполнением люмбальной пункции 30 ' 10⁹/л и выше. Если уровень тромбоцитов не удается повысить до 30 ' 10⁹/л и выше, при отсутствии клинических признаков поражения центральной нервной системы от пункции можно воздержаться до повышения тромбоцитов в гемограмме выше 30 ' 10⁹/л.

Если у пациента определяется лейкоцитоз выше 100 ' 10⁹/л, первую люмбальную пункцию следует отложить до редукции числа лейкоцитов менее 30 - 40 ' 10⁹/л.

Нейролейкемию диагностируют при обнаружении в спинномозговой жидкости, полученной при первой диагностической люмбальной пункции, любого количества бластных клеток при любом цитозе или цитоза 15/3 и более (т.е. более 5 клеток в 1 мкл).

- Рекомендуется всем пациентам выделять первичную ДНК или РНК из клеток костного мозга и сохранять ее в биобанке либо направлять материал на хранение в лаборатории Федеральных центров для возможности последующего выполнения молекулярных исследований [1, 2, 7].

Уровень убедительности рекомендаций - C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарий: сохранение первичного биологического материала осуществляется в виде ДНК и/или РНК, выделенных из костномозговых клеток или замороженных клеток. Материал может в последующем понадобиться для проведения молекулярных исследований, позволяющих определить группы риска, а также в рамках клинических исследований.