РУЧНОЙ МЕТОД ПОДСЧЕТА

Описание прибора и принцип испытания

Необходимо следующее оборудование:

- гемоцитометр: специальная камера в различных модификациях для микроскопического исследования. Камера состоит из толстого предметного стекла и покровного шлифованного стекла, предназначенного для разграничения камеры с определенным объемом для каждой модификации. На предметном стекле выгравированы глубокие бороздки, предназначенные для предупреждения перекрестного заполнения, и нанесена сетка, специфичная для каждой модели;

- световой микроскоп от 10x до 40x кратного увеличения;

- пипетки подходящего объема.

Гемоцитометр используют для определения количества клеток в суспензии путем расчета концентрации клеток в миллилитре (C), по формуле:

C = a · 10ⁿ · d

где: a - число подсчитанных клеток;

d - коэффициент разведения (при необходимости);

n - коэффициент, меняющийся в зависимости от объема камеры гемоцитометра.

В смешанной популяции распознавание клеток проводят по их различиям в размерах или окраске (например, лейкоциты и эритроциты).

Подготовка камеры для подсчета и анализ. Покровное стекло устанавливают на предметное стекло. Притирают покровное стекло, избегая наличия пузырьков воздуха в камере. Готовят подходящее разведение клеточной суспензии в растворе 9 г/л натрия хлорида P или буферном растворе с добавками для предотвращения гемолиза.

Подходящий объем разведенной клеточной суспензии помещают в камеру подсчета через щель, образующуюся между покровным стеклом и счетной камерой. Клеточная суспензия заполняет камеру подсчета благодаря капиллярности. Подсчет клеток в гемоцитометре проводят под микроскопом, настраиваемым так, чтобы были отчетливо различимы нанесенная сетка и клетки, распределенные на ней. Подсчитывают количество клеток на сетке и рассчитывают их концентрацию в разведенных и неразведенных образцах.

Для увеличения точности измерения необходимо соблюдать следующие меры предосторожности:

- используют покровное стекло подходящей толщины;

- по возможности, подсчитывают более 100 клеток (в случае необходимости считают большее количество квадратов);

- при обнаружении кластеров клеток (клеточная суспензия содержит не только единичные клетки, но и их скопления) суспензию ресуспендируют, отбирают образец и снова подсчитывают;

- для надлежащего подсчета клеток следует избегать неполного заполнения или переполнения счетной камеры.