МЕТОДИКА

Готовят 0,1% (об/об) суспензию обработанных папаином эритроцитов в холодном буферном растворе для фиксации клеток. В каждую лунку плоскодонного титрационного микропланшета помещают по 50 мкл суспензии.

Планшет центрифугируют при 350 g в течение 3 мин предпочтительно при температуре 4 °C. Не удаляя надосадочную жидкость, к содержимому каждой из лунок осторожно прибавляют по 100 мкл раствора глутарового альдегида и выдерживают 10 мин. Содержимое лунок сливают путем быстрого переворачивания планшета и трижды промывают каждую лунку 250 - 300 мкл ФСБ. Эту процедуру производят вручную или с использованием автоматического устройства для промывания планшетов. После удаления ФСБ планшет используют в испытании или хранят при температуре 4 °C не более 1 месяца после прибавления в каждую лунку по 100 мкл буферного раствора для фиксации клеток и запечатывания полимерной пленкой.

Испытуемые растворы. В случае лиофильно высушенных лекарственных препаратов их восстанавливают в соответствии с инструкцией по медицинскому применению. Готовят пять последовательных двукратных разведений, начиная с концентрации 30 МЕ/мл, с использованием ФСБ, содержащего 10 г/л альбумина бычьего P в четырех повторностях. При необходимости, исходное разведение корректируют с целью получения эффектов, попадающих в линейную область графика зависимости "доза - ответ".

Растворы сравнения. Восстанавливают стандартный образец (например, СО ФЕАЭС иммуноглобулина анти-D человека) в соответствии с указаниями производителя. Готовят пять последовательных двукратных разведений, начиная с концентрации 30 МЕ/мл, с использованием ФСБ, содержащего 10 г/л альбумина бычьего P, в четырех повторностях.

В каждую серию лунок титрационного микропланшета с круглой или конусообразной формами лунок вносят по 35 мкл соответствующего разведения испытуемого раствора или раствора сравнения. К содержимому каждой лунки прибавляют по 35 мкл биотинилированного Brad-5 в концентрации 250 нг/мл.

Осушают лунки планшета, покрытого эритроцитами, путем переворачивания и высушивания бумажным полотенцем. Прибавляют в каждую лунку по 250 мкл ФСБ, содержащего 20 г/л альбумина бычьего P, и выдерживают при температуре от 15 °C до 25 °C в течение 30 мин.

Осушают лунки планшета, покрытого эритроцитами, путем переворачивания и высушивания бумажным полотенцем, и помещают в каждую серию лунок по 50 мкл соответствующего испытуемого раствора или раствора сравнения, содержащих биотинилированный Brad-5.

В качестве отрицательного контроля используют 50 мкл ФСБ, содержащего 10 г/л альбумина бычьего P. Планшет запечатывают полимерной пленкой и инкубируют при температуре от 15 °C до 25 °C в течение 1 ч.

Удаляют жидкость из лунок планшета, покрытого эритроцитами, и трижды промывают каждую лунку 250 - 300 мкл ТСБ.

В каждую лунку прибавляют по 50 мкл авидина, конъюгированного со щелочной фосфатазой, или стрептавидина, конъюгированного со щелочной фосфатазой, разбавленного ТСБ, содержащим 10 г/л альбумина бычьего P. Инкубируют в течение 30 мин при температуре от 15 °C до 25 °C.

Удаляют жидкость из лунок планшета, покрытого эритроцитами, и трижды промывают каждую лунку 250 - 300 мкл ТСБ.

В каждую лунку прибавляют по 100 мкл раствора субстрата и инкубируют в темноте при температуре от 15 °C до 25 °C в течение 10 мин. Для остановки реакции в каждую лунку прибавляют по 50 мкл 3 M раствора натрия гидроксида P. Измеряют оптическую плотность при длине волны 405 нм. Для построения кривой из значений, полученных для испытуемых и стандартных растворов, вычитают значение, полученное для отрицательного контроля. Значения оптической плотности в линейной области калибровочной кривой используют для расчета активности испытуемого образца с использованием общепринятых статистических методов (2.3.12.0).