РЕАКТИВЫ

Реактивы, при отсутствии особых указаний, должны быть аналитической степени чистоты.

Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ). Растворяют в воде P 8,0 г натрия хлорида P, 0,76 г динатрия гидрофосфата безводного P, 0,2 г калия хлорида P, 0,2 г калия дигидрофосфата P и 0,2 г натрия азида P и доводят до объема 1000 мл этим же растворителем.

Трис-солевой буферный раствор (ТСБ). Растворяют в воде P 8,0 г натрия хлорида P и 0,6 г трис(гидроксиметил)аминометана P, корректируют pH (2.1.2.3) раствором 103 г/л хлороводородной кислоты P до значения 7,2 и доводят водой P до объема 1000 мл.

Раствор папаина. При температуре 37 °C перемешивают в течение 30 мин 1 г папаина P в 10 мл 0,067 M фосфатного буферного раствора с pH 5,4 P, центрифугируют при 10 000 g в течение 5 мин и фильтруют полученный раствор через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм. Для активации смешивают 1 мл фильтрата, 1 мл раствора 48,44 г/л L-цистеина P и 1 мл раствора 3,72 г/л натрия эдетата P и доводят 0,067 M фосфатным буферным раствором с pH 5,4 P до объема 10 мл. Аликвоты замораживают при температуре -20 °C или ниже.

Эритроциты. Пул D-положительных эритроцитов получают не менее чем от трех доноров с группой крови 0R₂R₂. Клетки четыре раза промывают ФСБ. Центрифугируют при 1800 g в течение 5 мин, надосадочную жидкость удаляют, подходящий объем осадка эритроцитов нагревают и смешивают с подходящим объемом предварительно нагретого раствора папаина (например, в объемном соотношении 2:1) и инкубируют при температуре 37 °C в течение 10 мин. Клетки четыре раза промывают ФСБ. Хранят при температуре 4 °C с подходящим стабилизатором не более недели.

Биотинилированный Brad-5. Используют в соответствии с инструкцией производителя.

Авидин, конъюгированный со щелочной фосфатазой, или стрептавидин, конъюгированный со щелочной фосфатазой. Предпочтительно использовать модифицированный реактив, сочетающий высокую специфическую активность с низким уровнем неспецифического связывания. Используют в соответствии с инструкциями производителя.

Раствор субстрата. Используют пара-нитрофенилфосфат в соответствии с инструкцией производителя.

Буферный раствор для фиксации клеток. Растворяют в воде P 18,02 г глюкозы P, 4,09 г натрия хлорида P, 1,24 г борной кислоты P, 10,29 г натрия цитрата P и 0,74 г натрия эдетата P. Корректируют pH (2.1.2.3) до значения 7,2 - 7,3, используя раствор 40 г/л натрия гидроксида P или раствор 103 г/л хлороводородной кислоты P, и доводят водой P до объема 1000 мл. Хранят при температуре 4 °C и используют холодным.

Раствор глутарового альдегида. Непосредственно перед применением 750 мкл раствора 250 г/л глутарового альдегида P прибавляют к 50 мл холодного ФСБ.

Титрационные микропланшеты. Плоскодонные планшеты из полистирола со свойствами поверхности, оптимизированными для иммуноферментного анализа, с высокой связывающей способностью по отношению к белкам используют для покрытия эритроцитами. Планшеты из полистирола или поливинилхлорида с круглой или конусообразной формами лунок используют для приготовления разведений растворов иммуноглобулина.