ИЗБИРАТЕЛЬНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ ПЕПТИДНЫХ СВЯЗЕЙ

Выбор подхода, используемого для расщепления пептидных связей будет зависеть от анализируемого белка. Процедура выбора включает определение типа расщепления (химического или ферментативного), а также типа протеолитического реагента в рамках выбранной категории. В таблице 2.1.2.39.-1 приведен ряд протеолитических реагентов и параметры их специфичности. Данный список не является исчерпывающим и будет дополняться по мере определения других реагентов, способных расщеплять пептидные связи.

Таблица 2.1.2.39.-1. - Примеры реагентов для расщепления пептидных связей

Предварительная обработка образца. В зависимости от размера или конфигурации белка используют различные подходы к предварительной обработке образца. Если для расщепления пептидных связей белка с молекулярной массой более 100 000 Да используют трипсин, остатки лизина должны быть защищены путем получения производных с цитраконовым или малеиновым ангидридами, так как в противном случае может образоваться слишком много пептидных фрагментов.

Предварительная обработка расщепляющего агента. Предварительная обработка расщепляющего агента, особенно ферментов, может быть необходима для обеспечения требуемой чистоты и воспроизводимости карты. Например, трипсин, используемый в качестве реагента для расщепления пептидных связей, следует обработать тозил-L-фенилаланинхлор-метилкетоном с целью инактивации химотрипсина. Другие методы, например, очистка трипсинаметодом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или иммобилизация фермента на гелевом носителе, успешно используются, особенно при ограниченном количестве имеющегося белка.

Предварительная обработка белка. При определенных условиях может потребоваться концентрирование образца или отделение белка от используемых в готовом продукте вспомогательных веществ и стабилизаторов, если они мешают процедуре картирования. Используемые для предварительной подготовки белка физические процедуры могут включать ультрафильтрацию, колоночную хроматографию и лиофилизацию. С целью проведения денатурации белка до процедуры пептидного картирования возможно использование других методов подготовки, таких как добавление хаотропных агентов (например, мочевины). Для обеспечения полного доступа фермента к местам разрыва связей и частичной денатурации белка часто до проведения про теолитического расщепления необходимо восстановление и алкилирование дисульфидных связей. Расщепление пептидных связей с использованием трипсина может сопровождаться появлением в пептидной карте ряда неточностей ввиду протекающих параллельно с реакцией протеолитического расщепления побочных реакций, таких как неспецифическое расщепление, дезаминирование, дисульфидная изомеризация, окисление остатков метионина, образование пироглутаминовых групп при дезаминировании глутамина на N-концевой стороне пептида. Более того, при автогидролизе трипсина также могут появляться дополнительные пики. Интенсивность их образования зависит от соотношения содержания трипсина к белку. Для предотвращения автогидролиза растворы протеаз могут быть приготовлены при pH, отличном от оптимального значения (например, при pH 5 для трипсина), благодаря чему фермент не перейдет в активное состояние до момента разведения с буферным раствором при проведении расщепления.

Установление оптимальных условий для расщепления пептидных связей. Факторы, которые влияют на полноту и эффективность расщепления протеинов, являются факторами, оказывающими влияние на химические и ферментативные реакции.

pH реакционной среды. Значение pH смеси, в которой осуществляется расщепление пептида, определяется эмпирически что обеспечивает оптимизацию состояния расщепляющего реагента. Например, при использовании бромциана в качестве расщепляющего реагента необходимым является создание сильнокислой среды (например, pH 2, муравьиная кислота); однако при использовании трипсина в качестве расщепляющего агента оптимальной является слабощелочная среда (pH 8). В целом значение pH реакционной среды не должно изменять химическую структуру белка в ходе реакции расщепления и не должно изменяться в ходе проведения реакции фрагментации.

Температура. Для большинства реакций расщепления наиболее подходящей является температура в интервале от 25 °C до 37 °C. Создаваемая температура должна способствовать минимизации побочных химических реакций. Тип испытуемого белка определяет выбор температуры реакционной среды, поскольку некоторые белки с повышением температуры склонны к денатурации. Например, расщепление рекомбинантного бычьего соматропина проводится при температуре 4 °C, поскольку при более высокой температуре он осаждается в ходе проведения реакции расщепления.

Время. В случае если имеется достаточное количество испытуемого образца, следует провести испытание по определению времени, являющегося оптимальным для получения воспроизводимой карты и достаточным для проведения полного расщепления. Продолжительность расщепления варьируется от 2 ч до 30 ч. Реакция прекращается либо прибавлением кислоты, которая не оказывает влияния на полученную пептидную карту, либо замораживанием.

Количество используемого расщепляющего реагента. Для обеспечения достаточного быстрого расщепления (от 6 ч до 20 ч) используется избыточное количество расщепляющего реагента; тем не менее, его количество должно быть минимизировано, чтобы предотвратить вклад реагента в структуру пептидной карты. Обычно анализируемый протеин и реагент берут в соотношении 20:1 или 200:1. Для оптимизации процедуры расщепления рекомендуется добавлять расщепляющий агент в два или более этапов. При этом конечный объем реагирующей смеси должен оставаться достаточно небольшим для обеспечения следующего этапа пептидного картирования - разделения. Для того, чтобы исключить возможное влияние искажающих продуктов расщепления (артефактов) на результаты последующего анализа, проводится контрольное определение со всеми реагентами за исключением анализируемого белка.