ИМИТАЦИЯ ПРОИЗВОДСТВЕННОГО ПРОЦЕССА

Процессы наработки продукта, содержащего целевой белок

Антигены для процесс-специфичного метода количественного определения остаточных белков клетки-хозяина получают, имитируя планируемый производственный процесс с использованием нулевой клеточной линии и, где это возможно, в одних и тех же условиях производства.

Любая имитация производственного процесса является приближением к предполагаемому производственному процессу, поэтому они могут иметь отличия, например, различный масштаб, рабочие параметры, взаимодействие продуктов. Такие отличия необходимо тщательно оценить, так как они могут повлиять на совокупность видов белков клетки-хозяина.

Например, при имитации стадии ферментации процесса производства телец включения, получение желаемых телец включения может быть не достигнуто. В связи с этим, в зависимости от используемой нулевой клеточной линии (например, ложно трансфицированной или не трансфицированной), антигены получают иначе, чем в предполагаемом производственном процессе.

В отдельных случаях для некоторых параметров производственного процесса при имитации производства может потребоваться корректировка с учетом наихудшего случая (например, для получения антигенов, охватывающих широкий спектр различных видов белков клетки-хозяина). Например, супернатант клеточной культуры, содержащий антиген, может быть собран уже после достижения минимального уровня жизнеспособности клеток, чтобы включить больше цитозольных белков, которые высвобождаются при дополнительном лизисе клеток.

Процессы выделения и очистки целевого белка

Полученные антигены подвергают щадящему воздействию (фильтрации, концентрированию) с целью получения репрезентативного спектра белков клетки-хозяина. Дальнейшую очистку обычно не рекомендуется, так как существует риск потери видового разнообразия остаточных белков. В случаях, когда не достигнута репрезентативность антигенов (например, в результате узкого охвата), можно рассмотреть возможность смешивания имитационных материалов с различных этапов обработки. Возможно увеличение разнообразия антигенов путем объединения материалов, полученных в результате имитации ферментации и (или) очистки с использованием различных производственных условий, или селективных этапов очистки (например, для уменьшения общего количества некоторых иммунодоминантных остаточных белков клетки-хозяина).

Перекрестная контаминация целевым белком

Существенным фактором риска при получении антигенов, используемых в качестве реактивов, является контаминация целевым белком с последующей перекрестной реакцией с поликлональными антителами, что необходимо учитывать при организации производственного и лабораторного процессов. По этой причине при получении антигенов максимально используют специальное или одноразовое оборудование. Когда это невозможно, оборудование должно быть очищено соответствующим образом.

Определение характеристик и испытания

Перед использованием антигенов для иммунизации в них определяют общее содержание белка и подтверждают отсутствие целевого белка.

Сравнение совокупности белков клетки-хозяина, полученных в результате имитированного и предполагаемого производственных процессов, выполняют, как правило, при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с натрия додецилсульфатом и (или) двумерного электрофореза с высокочувствительным красителем. Сравнение должно показать, что антигены, полученные при имитации процесса, содержат большинство видов белков клетки-хозяина предполагаемого производственного процесса. При необходимости дополнительная информация может быть получена с помощью ортогональных методов (например, масс-спектрометрии).