АМПЛИФИКАЦИЯ

Обнаружение и определение остаточной ДНК клетки-хозяина методом кПЦР-РВ может включать использование ДНК зондов, специфичных к последовательности нуклеотидов, или неспецифического флуоресцентного красителя, интеркалирующего с любой двуцепочечной ДНК. Принципы метода кПЦР-РВ описаны в общей фармакопейной статье 2.1.6.17. Методы амплификации нуклеиновых кислот.

Количество циклов, необходимых для превышения порогового значения (Ct или Cp) при флуоресцентном измерении, зависит от исходного количества остаточной ДНК клетки-хозяина в образце.

Если выполняется несколько выделений, извлеченные пробы, при необходимости, после подходящего разведения, должны иметь сопоставимую концентрацию ДНК клетки-хозяина.

Используют образцы для отрицательного контроля ПЦР.

Стандартную кривую содержания геномной ДНК строят с использованием серий разведений стандартного раствора геномной ДНК клетки-хозяина, чтобы можно было определить остаточные уровни ДНК клетки-хозяина в биотехнологических лекарственных средствах на основе их значений Ct или Cp. Для приготовления стандартного раствора рекомендуется использовать тщательно охарактеризованную репрезентативную геномную ДНК, выделенную из клеток, используемых для производства биотехнологического лекарственного средства.

Аналогичный подход применяют для оценки распределения по размеру остаточной ДНК клетки-хозяина. Для амплификации перекрывающихся фрагментов разного размера в целевой последовательности нуклеотидов могут быть использованы как минимум два набора праймеров.