5-2. МЕТОД МЕМБРАННОЙ ФИЛЬТРАЦИИ

Метод мембранной фильтрации используют для количественного и качественного определения микроорганизмов в ЛС, обладающих или не обладающих антимикробным действием, в частности для растворов и водорастворимых ЛС, а также для жиросодержащих препаратов, растворимых в изопропилмиристате (ИПМ).

5-2-1. Условия проведения испытания. Установка для мембранной фильтрации должна иметь конструкцию, из которой легко извлекается фильтр, с последующим его переносом на питательные среды. Используют мембранные фильтры с диаметром пор не более 0,45 мкм, способные эффективно задерживать микроорганизмы, что необходимо подтвердить валидацией. Материал мембраны следует выбирать таким образом, чтобы компоненты исследуемого препарата не влияли на эффективность его работы. Фильтры из нитрата целлюлозы используют для водных, масляных и разбавленных спиртовых растворов (менее 30%), из ацетата целлюлозы - для спиртовых растворов (более 30%), кислот, щелочей. Мембранную фильтрацию проводят в асептических условиях с помощью вакуума.

5-2-2. Выполнение испытания. Испытуемый образец, как правило, растворяют в буферном растворе в соотношении 1:10. В воронку фильтровальной установки вносят сначала промывную жидкость (примерно 5 мл) для смачивания фильтра. Добавляют количество раствора препарата, соответствующее 1 г испытуемого образца, и немедленно фильтруют. В случае наличия антимикробного действия испытуемого образца для отмывания мембраны используют 0,9% раствор натрия хлорида или описанные ниже жидкости (N 1, N 2, N 3), для чего через фильтр пропускают не менее 3 порций по 100 мл подходящей стерильной промывной жидкости. При необходимости к промывной жидкости могут быть добавлены поверхностно-активные вещества (например, полисорбат-80) или инактиваторы антимикробного действия. Через 1 мембрану можно пропускать не более 500 мл промывной жидкости.

Допускается использование для отмывания мембран менее 3 порций промывной жидкости при условии валидации метода.

Для того чтобы определить, полностью ли отмыты мембраны от фильтруемого испытуемого образца, обладающего антимикробным действием, после фильтрации раствора в последнюю порцию промывной жидкости вносят по 1 мл взвеси тест-штаммов микроорганизмов (для каждого в отдельности), соответствующих типу проводимого испытания. Концентрация клеток вносимой взвеси тест-штамма не должна превышать 100 КОЕ в 1 мл.

Рост тест-штаммов на фильтрах подтверждает отсутствие антимикробного действия. В случае, если антимикробное действие сохраняется, используют специфические или неспецифические инактиваторы или увеличивают объем промывной жидкости.

Смыв с трансдермальных пластырей пропускают через мембранные фильтры по 50 мл (соответствует 1 пластырю) через каждую мембрану.

По окончании процесса фильтрации мембраны переносят на соответствующие питательные среды, разлитые в чашки Петри или флаконы с жидкими питательными средами. Чашки с фильтрами переворачивают. Посевы на чашках и во флаконах инкубируют в стандартных условиях.

5-2-3. Учет и интерпретация результатов. Предварительный просмотр посевов производят через 24 - 72 ч и фиксируют окончательный результат через 5 - 7 сут.

Отбирают чашки, в которых число колоний бактерий на фильтрах не превышает 100, а грибов - 50, и рассчитывают число микроорганизмов на 1,0 г (1,0 мл) испытуемого образца или на 1 пластырь. Если на фильтре большее количество микроорганизмов, то делают ряд последовательных разведений испытуемого образца и выбирают подходящее.

Учет результатов на жидких питательных средах проводят в соответствии с ОФС 2.1.6.6

5-2-4. Жидкости для промывания фильтров. Для промывания фильтров можно использовать любую стерильную жидкость, не подавляющую рост микроорганизмов:

- 0,9% раствор натрия хлорида pH (7,0 +/- 0,2) (после стерилизации);

- жидкость N 1: растворяют 1 г ферментативного пептона в 1000 мл воды очищенной, фильтруют или центрифугируют для осветления, разливают в сосуды и стерилизуют; pH после стерилизации (7,0 +/- 0,2);

- жидкость N 2: добавляют 1 мл полисорбата-80 к 1000 мл жидкости N 1, разливают во флаконы и стерилизуют. Величина pH после стерилизации (6,9 +/- 0,2). Жидкость N 2 применяют, если в составе препарата имеется масло;

- жидкость N 3: растворяют 5 г мясного пептона, 3 г мясного экстракта и 10 г полисорбата-80 в 1000 мл воды очищенной. Разливают во флаконы и стерилизуют; pH после стерилизации (6,9 +/- 0,2).