КАЛИБРОВКА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ

Хроматографируют несколько раз выбранный объем маркерного раствора. На хроматограмме должны присутствовать 2 пика: первый пик соответствует СО ФЕАЭС декстрана V₀, второй пик - глюкозе P. Исходя из объема элюирования декстрана V₀, рассчитывают объем эксклюзии V₀; полный объем V_t рассчитывают по пику, соответствующему глюкозе.

Хроматографируют определенный объем каждого из калибровочных растворов. Для каждой полученной хроматограммы проводят базовую линию. Каждую хроматограмму делят вертикальными равноудаленными линиями на p секций (количеством не менее 60), что соответствует равным объемам элюирования. Для каждой секции i, соответствующей объему элюирования V_i, измеряют высоту (y_i) от базовой линии до линии хроматограммы и рассчитывают коэффициент распределения (K_i) по формуле:

, (1)

где: V₀ - объем эксклюзии, определенный по пику, соответствующему СО ФЕАЭС декстрана V₀ на хроматограмме маркерного раствора;

V_t - полный объем колонки, определенный по пику, соответствующему глюкозе на хроматограмме маркерного раствора;

V_i - объем элюирования для секции i, полученный для хроматограммы каждого из калибровочный растворов.

Калибровку проводят, используя один из следующих методов.

Калибровка путем построения калибровочного графика. По уравнению (1) для каждого из декстранов для калибровки рассчитывают коэффициент распределения K_max, соответствующий максимальной высоте линии хроматограммы. На полулогарифмической бумаге строят зависимость значений K_max (ось абсцисс) от молекулярной массы для максимальной высоты линии хроматограммы (M_max) каждого из декстранов для калибровки и глюкозы (ось ординат). Через все полученные точки проводят первую калибровочную линию, экстраполируя ее из точки K_max, полученной для СО ФЕАЭС декстрана 250 для калибровки, до более низких значений K, полученных для тех же стандартных растворов (см. рисунок 2.1.2.49.-1).

Рисунок 2.1.2.49.-1. - Пример калибровочного графика. Пунктиром обозначена часть калибровочного графика, полученная экстраполированием. Горизонтальными линиями в нижней части рисунка указаны ширина и положения хроматографических линий, полученных для каждого декстрана для калибровки

Используя полученный первый калибровочный график, находят для всех значений K_i для всех хроматограмм соответствующие значения молекулярных масс M_i, получая таким образом графическую зависимость для расчета молекулярно-массового распределения. Для каждого декстрана для калибровки рассчитывают среднюю молекулярную массу по уравнению (3), приведенному ниже. Калибровочный график может быть использован для расчетов, если рассчитанные значения для каждого из декстранов для калибровки не отличаются от указанных в сопроводительной документации значений больше чем на 5% и среднее отклонение для всех декстранов не превышает +/- 3%. Если данные условия не выполняются, калибровочный график смещают вдоль оси ординат и повторяют вышеописанные операции, пока рассчитанные и указанные в сопроводительной документации значения будут отличаться не более чем на 5%.

Калибровка при помощи расчетного метода. При помощи уравнений (2) и (3), приведенных ниже, и подходящего метода (возможно использование итеративного метода, такого как модифицированного Хартли метода Гаусса-Ньютона; также возможно построение кривой при помощи компьютерных программ, которые используют принцип нелинейного регрессионного анализа) рассчитывают значения коэффициентов b₁, b₂, b₃, b₄ и b₅, которые должны составлять для глюкозы 180 +/- 2, а для декстранов для калибровки могут отличаться не более чем на 5% от соответствующих значений, указанных в сопроводительной документации.

, (2)

, (3)

где: p - число секций, на которые поделена хроматограмма;

y_i - высота хроматографической линии над базовой линией в i-той секции;

M_i - молекулярная масса для секции i.