ПРОЦЕСС-СПЕЦИФИЧНЫЕ И ПЛАТФОРМЕННЫЕ МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕНННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ БЕЛКОВ

Иммунизация

Для получения поликлональных антител иммунизируют один или несколько подходящих видов животных. Основной задачей иммунизации является получение высокоспецифичных поликлональных антител, чувствительных к каждому из антигенных белков в смеси белков клетки-хозяина, используемой в качестве иммуногена. Иммунный ответ животного должен индуцироваться как высокоиммунными, так и низкоиммунными антигенами.

Выбирают вид животного, позволяющее получать достаточное количество и разнообразие специфического к белкам клетки-хозяина иммуноглобулина G.

Если поликлональные антитела для образования иммунного комплекса антиген - антитело (первичные антитела) и для детекции результатов реакции (вторичные антитела) получены из одного и того же источника, можно предположить, что при проведении количественного определения они распознают разные эпитопы на одном и том же белке клетки-хозяина. Альтернативно можно использовать поликлональные антитела к белкам клетки-хозяина от разных видов животных. Использование нескольких животных для каждого из данных видов позволяет уменьшить влияние индивидуальной изменчивости иммунной системы и обеспечить дополнительное разнообразие ответов, что будет способствовать максимальному охвату антителами против антигенов белков клетки-хозяина.

В случае ограниченного количества антигенов использование адъювантов сокращает время формирования иммунного ответа. В случае сложного состава смеси антигенов может потребоваться дифференциальное усиление иммунного ответа к низкоиммуногенным антигенам или к антигенам в более низких концентрациях.

Для достижения максимального иммунного ответа может потребоваться несколько циклов иммунизации, и, в зависимости от частоты иммунизации, процесс может занять от 3 до 6 месяцев.

Иммунный ответ на белки клетки-хозяина для конкретной схемы иммунизации контролируют путем определения титра антител с использованием, например, ИФА, и путем сравнения результатов одно- или двумерного электрофореза после окрашивания белков и вестерн-блоттинга, где в качестве первичных антител используют поликлональные антитела к белкам клетки-хозяина. На практике некоторые белки, вызывающие сильный иммунный ответ, могут быть не видны в геле при окрашивании, а некоторые белки со слабыми антигенными свойствами, обнаруживаемые при окрашивании белков, могут не вызывать детектируемый иммунный ответ. В мультиплексных иммунологических испытаниях для достижения линейности при разведении образца важно, чтобы реактив, содержащий антитела, одновременно и специфически распознавал как можно больше отдельных молекул в образце и присутствовал в стехиометрическом избытке. Для этой цели серии разведений испытуемых образцов, полученных на разных стадиях производственного процесса, предварительно оценивают с помощью твердофазного ИФА, используя для этого очищенные антитела белков клетки-хозяина, показавшие высокую эффективность в вестерн-блоттинге.

На основании результатов описанных выше испытаний антисыворотки от разных животных объединяют, повторно испытывают и очищают.

Очистка и подготовка

Антитела к белкам клетки-хозяина должны быть очищены. Как правило, применяют аффинную хроматографию на основе связывания с белком A или белком G и (или) аффинную хроматографию на основе антигена белка клетки-хозяина.

Может потребоваться дополнительная очистка для удаления потенциальных агрегатов с помощью эксклюзионной хроматографии.

Для ИФА часть очищенных антител к белкам клетки-хозяина конъюгируют с меткой, необходимой для детекции результатов реакции (например, биотином или пероксидазой хрена).

Очищенные антитела к белкам клетки-хозяина и антисыворотки хранят при температуре, обеспечивающей их стабильность.

Определение характеристик и испытания

Полученные и используемые в качестве реактивов поликлональные антитела должны обеспечивать связывание максимального спектра белков антигена и не давать перекрестной реакции с целевым белком. Их пригодность оценивают путем подтверждения охвата белков клетки-хозяина, характерных для производственного процесса.

Для этого проводят двумерный электрофорез антигенов белков клетки-хозяина. Полученный белковый профиль после иммуноокрашивания сравнивают с белковым профилем, полученным при окрашивании неселективным красителем. Антитела к белкам клетки-хозяина должны распознавать широкий спектр белков клетки-хозяина при любых зарядах и молекулярных размерах. Могут быть рассмотрены другие подходящие методы.