МЕТОД 8

Восстановление и алкилирование цистеина/цистина происходит при пиридилэтилировании в жидкой фазе.

Исходные растворы. Готовят и фильтруют 3 раствора: 1 M раствор трис-гидрохлорида с pH 8,5, содержащий 0,004 M динатрияэдетата (исходный раствор A); 8 M раствор гуанидина гидрохлорида (исходный раствор B); 10% раствор 2-меркаптоэтанола (исходный раствор C).

Восстанавливающий раствор. Для получения буферного раствора 6 M раствора гуанидина гидрохлорида в 0,25 M растворе трис-гидрохлорида смешивают 1 объем исходного раствора A и 3 объема исходного раствора B.

Методика. Около 10 мкг испытуемого образца растворяют в 50 мкл восстанавливающего раствора и прибавляют около 2,5 мкл исходного раствора C. Выдерживают при комнатной температуре в защищенном от света месте в атмосфере азота или аргона в течение 2 ч. Для проведения реакции пиридинэтилирования к раствору белка прибавляют около 2 мкл 4-винилпиридина и выдерживают дополнительно 2 ч при комнатной температуре в защищенном от света месте. Обессоливают белок/пептид методом обращенно-фазовой ВЭЖХ, собирая белковую/пептидную фракцию. Перед кислотным гидролизом собранный образец может быть высушен при помощи вакуумного центрифугирования.