ПОСЕВ В ЧАШКУ И ПОДСЧЕТ

Суспензию клеток в культуральной среде смешивают с полужидкой средой. Обычно 1 мл смеси вносят в необработанную стерильную чашку Петри (диаметром 35 мм).

Из-за вязкости среды смесь не может быть нанесена на чашку с помощью автоматического дозатора, и требуется использование шприцов с иглами большого диаметра (размер 18G и менее).

Количество клеток, высеваемых в чашку Петри, зависит от концентрации гемопоэтических прогениторных клеток в испытуемом образце. Количество клеток должно приводить к образованию от 40 до 80 колоний на чашку (диаметром 35 мм), для предотвращения образования одной колонии из двух разных гемопоэтических прогениторных клеток.

Целевое количество колоний на чашку может быть рассчитано из процентного содержания клеток CD34+ (или из концентрации клеток CD34+ в миллилитре), определенного методом проточной цитометрии (2.1.6.16) или путем использования различных разведений клеточной суспензии (как правило, проверяют не менее двух концентраций).

Чашки инкубируют в аэробных условиях с концентрацией углекислого газа 5% при температуре 37 °C во влажной (насыщенной) атмосфере в течение 10 - 14 сут и подсчитывают количество колоний с использованием инвертированного микроскопа. При манипуляциях с чашками, содержащими колонии, соблюдают меры предосторожности, поскольку среда с метилцеллюлозой является вязкой, но не желеобразной. Наклон чашки может привести к формированию сливающихся и кометообразных колоний, что делает подсчет некорректным.