РАСЧЕТ И АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННЫХ ДАННЫХ

При определении содержания аминокислот в белковом/пептидном гидролизате следует учитывать, что при кислотном гидролизе триптофан и цистеин разрушаются, серин и треонин разрушаются частично, в то время как связи по остаткам изолейцина и валина расщепляются не полностью. Метионин во время кислотного гидролиза может подвергаться окислению, в результате чего появляются свободные аминокислоты (например, глицин и серин), загрязняющие образец. Использование вакуума (менее 200 мкм ртутного столба, или 26,7 Па) или введение инертного газа (аргон) в пространство реакционного сосуда может уменьшить степень окислительной деструкции. Поэтому количественные результаты, полученные для цистеина, триптофана, треонина, изолейцина, валина, метионина, глицина и серина из белкового/пептидного гидролизата, могут быть непостоянными и служить основанием для дальнейшего исследования и анализа.

Мольный процент аминокислоты - это количество остатков определенной аминокислоты на 100 остатков в белке. Эта величина может быть полезной при оценке данных, полученных при аминокислотном анализе, если молекулярная масса исследуемого белка неизвестна. Информация также может быть использована для подтверждения подлинности белка/пептида или для других целей. Мольный процент каждой аминокислоты в испытуемом образце рассчитывают по формуле:

,

где: r_U - сигнал пика аминокислоты в испытуемом образце, проинтегрированный в наномолях

r - сумма сигналов пиков всех аминокислот в испытуемом образце, проинтегрированных в наномолях.

Сравнение полученного в испытании мольного процента аминокислот с данными известных белков может помочь установить или подтвердить подлинность испытуемого образца белка.

Образцы неизвестного белка. Этот метод расчета может быть использован для оценки концентрации белка в образце неизвестного белка с использованием данных, полученных при аминокислотном анализе. Массу каждой высвобождаемой аминокислоты рассчитывают в микрограммах по формуле:

,

где: m - количество аминокислоты, определенное в испытании, в наномолях;

M_r - средняя молекулярная масса данной аминокислоты, скорректированная с учетом массы молекулы воды, удаленной при образовании пептидной связи.

Суммируя массы высвобожденных аминокислот, получают общую массу анализируемого белка после соответствующей коррекции с учетом частично или полностью разрушенных аминокислот. Если известна молекулярная масса неизвестного белка (например, определенная методом гель-электрофореза в полиакриламидном геле с натрия додецилсульфатомили методом масс-спектрометрии), можно установить аминокислотный состав неизвестного белка. Число остатков каждой аминокислоты рассчитывают по формуле:

,

где: m - количество аминокислоты определенное в испытании, в наномолях

M - общая масса белка, в микрограммах

M_rt - молекулярная масса неизвестного белка.

Образцы известного белка. Этот метод расчета может быть использован для установления аминокислотного состава и концентрации белка в образце белка с известной молекулярной массой и аминокислотным составом с использованием данных, полученных при аминокислотном анализе. При анализе состава известного белка учитывают, что некоторые аминокислоты высвобождаются хорошо, в то время как открываемость других аминокислот может быть затруднена вследствие полного или частичного разрушения (например, триптофан, цистеин, треонин, серин, метионин), неполного расщепления связей (например, изолейцин и валин), контаминации свободными аминокислотами (например, глицин и серин).

Для определения количественного содержания белка используют аминокислоты, открываемость которых наилучшая. Хорошо открываемыми аминокислотами обычно являются: аспартат-аспарагин, глутамат-глутамин, аланин, лейцин, фенилаланин, лизин и аргинин. Этот перечень может изменяться на основании наработанного опыта по проведению анализа. Для определения количественного содержания белка по каждой хорошо открываемой аминокислоте количество каждой хорошо открываемой аминокислоты, в наномоль, делят на предполагаемое количество остатков этой аминокислоты в белке. Рассчитывают среднее значение содержания белка. Значения содержания белка, установленные по количеству каждой хорошо открываемой аминокислоты, должны быть равномерно распределены относительно среднего значения. В тех случаях, когда значения содержания белка, определенные по этим аминокислотам, имеют неприемлемые отклонения (обычно более 5%) от средней величины, их отбрасывают. С учетом оставшихся значений пересчитывают среднее содержание белка в испытуемом образце. Для определения аминокислотного состава испытуемого образца содержание каждой аминокислоты делят на рассчитанное среднее значение содержания белка. Относительную ошибку определения аминокислотного состава рассчитывают в процентах по формуле:

,

где: m - экспериментально установленное количество аминокислот в наномоль на аминокислотный остаток;

m_s - известное значение остатков для этой аминокислоты.

Среднее значение относительной ошибки определения аминокислотного состава является средним значением абсолютных величин относительных ошибок определения каждой аминокислоты, обычно кроме расчета данных по триптофану и цистеину. Средняя величина относительной ошибки определения аминокислотного состава может дать важную информацию об устойчивости анализа во времени. Соответствие найденного аминокислотного состава образца белка и известного состава может служить подтверждением подлинности и чистоты белка в испытуемом образце.

201020041-2019