ВЫБОР ПАРАМЕТРОВ

В проточной цитометрии используют коммерчески доступные моноклональные антитела, конъюгированные с флуорофором, стандартные процедуры окрашивания и лизиса цельной крови, а также применяют стратегию гейтирования с использованием светорассеяния и иммунофлуоресцентного анализа с применением комбинации пан-CD34/CD45 моноклональных антител.

Жизнеспособность клеток CD34+/CD45+ можно определить с помощью соответствующего окрашивания нуклеиновых кислот красителем, не проникающим через интактную клеточную мембрану (например, 7-аминоактиномицин D).

Выбор моноклональных антител

Антитела к CD34. Для обнаружения всех вариантов гликозилирования молекулы (например, клон 8G12 или 581) используют антитела к CD34 класса III. Для обнаружения редких эффектов используют антитела, конъюгированные с флуорофорами (например, фикоэритрином), имеющими максимальное свечение при использовании проточного цитометра с аргоновым лазером.

Антитела к CD45. Необходимо использовать пан-CD45 антитела, обнаруживающие все изоформы и все гликоформы этой структуры. Обычно используют антитела к CD45, конъюгированные с флуоресцеин-5-изотиоцианатом (ФИТЦ) в качестве флуорофора (например, J33, HLe1, 2D1).

Контроли изотипов и изоклонов. Для обнаружения неспецифичных сигналов в области флуоресценции фикоэритрина используют отрицательный контроль. При применении контроля изотипов (моноклональные антитела к нерелевантным антигенам того же изотипа, что и используемые антитела к CD34) фикоэритрин-конъюгированный изотип объединяют с CD45-ФИТЦ (или PerCP). При применении контроля изоклонов неконъюгированные (в избытке) и фикоэритрин-конъюгированные моноклональные антитела, идентичные антителам к CD34, объединяют с конъюгированными антителами к CD45. Могут быть использованы альтернативные комбинации.

Определение абсолютного количества клеток CD34+/CD45+

Калиброванные флуоросферы. В зависимости от применяемого оборудования, внутренний стандарт может представлять собой калиброванные сферы, находящиеся в суспензии, или может быть помещен непосредственно в прилагаемые производителем пробирки.

Абсолютное количество клеток CD34+/CD45+ в миллилитре рассчитывают по формуле:

где: A - количество подсчитанных клеток CD34+/CD45+;

B - количество подсчитанных флуоросфер;

C - известная концентрация флуоросфер.

Стратегии гейтирования

Целью стратегии гейтирования является последовательный выбор интересующей популяции и одновременная минимизация интерференции, вызываемой дебрисом (фрагментами клеток) и зрелыми клетками, с которыми антитела могут неспецифически связываться. При использовании коммерческих наборов применяют стратегию гейтирования, рекомендованную производителем набора. При использовании собственной методики применяют существующие рекомендуемые стратегии. Стратегия гейтирования, учитывающая параметры светорассеяния и флуоресценцию, будет обеспечивать правильную идентификацию и подсчет клеток CD34+/CD45+.

Количество обрабатываемых событий

Для достижения приемлемых правильности и прецизионности анализируют достаточное количество событий, например, не менее 100 событий CD34+ и не менее 60 000 событий CD45+; общее количество клеток может быть выше при условии, если процентное содержание CD34 составляет 0,1% или менее.