АНАЛИЗ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПЕПТИДОВ

В данном разделе приведено руководство по использованию пептидного картирования при разработке частных фармакопейных статей и нормативных документов по качеству при регистрации лекарственных средств.

Использование пептидной карты как инструмента качественного определения не требует полной характеристики индивидуальных пептидных пиков. Однако валидация методики пептидного картирования при разработке частных фармакопейных статей и нормативных документов по качеству требует точной характеристики каждого из индивидуальных пиков пептидной карты. Для характеристики индивидуальных пиков могут быть использованы как метод N-концевого секвенирования с последующим анализом аминокислот, так и метод с использованием масс-спектроскопии.

Для составления характеристики пиков с использованием N-концевого секвенированияи аминокислотного анализа проводят масштабирование стадии аналитического разделения. Необходимо убедиться на основании эмпирических данных, что ухудшения разрешения между пиками вследствие проведения масштабирования не происходит. Элюаты, соответствующие специфическим пептидным пикам, собирают, концентрируют в вакууме и, при необходимости, повторно хроматографируют. Аминокислотный анализ фрагментов может быть ограничен размером пептидов. В случае если N-концевая аминокислота заблокирована, может потребоваться ее высвобождение до секвенирования. С целью получения характеристики может также использоваться C-концевое секвенирование белков в комбинации с карбоксипептидазой и методом матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации с время пролетным масс-анализатором.

Использование масс-спектроскопии для характеристики пептидных фрагментов производится либо путем непосредственного введения выделенных пептидов, либо с использованием online системы ВЭЖХ с масс-спектрометром для структурного анализа. В целом он включает электрораспыление и масс-спектрометрию методом матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации с время пролетным масс-анализатором, а также бомбардировку быстрыми атомами. Тандемная масс-спектроскопия также используется для определения последовательности модифицированных белков и типа произошедшей аминокислотной модификации. Сравнение масс-спектров продуктов гидролиза до и после восстановления обеспечивает определение расположения дисульфидных связей в различных сульфгидрилсодержащих пептидах.

Если некоторые части первичной структуры не могут быть достаточно четко отражены пептидной картой, может потребоваться составление вторичной пептидной карты. Целью валидированной методики для характеристики белка по средством пептидного картирования является определение как минимум 95% теоретического состава структуры белка.

201020040-2019