ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ

Для картирования используют различные методы разделения белков. Выбор метода зависит от белка, для которого составляется пептидная карта. В таблице 2.1.2.39.-2 перечислены методы, успешно используемые для разделения пептидов. В данном разделе приведено описание метода обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), одного из наиболее часто используемых методов хроматографического разделения.

Таблица 2.1.2.39.-2. - Методы, используемые для разделения пептидных фрагментов

Критическими факторами при ВЭЖХ разделении являются чистота растворителей и подвижной фазы. Для проведения обращенно-фазовой ВЭЖХ рекомендуется использование растворителей и воды степени чистоты "для ВЭЖХ". Растворенные газы являются проблемой для градиентных систем в тех случаях, когда растворимость газа в растворителе может быть меньше в смеси, чем в самом растворителе. В качестве эффективного способа дегазации может быть использована вакуумная дегазация и воздействие ультразвуком. В случае если твердые частицы в растворителе попадут в хроматографическую систему, они могут нарушить герметичность клапанов насоса или засорить верхнюю часть хроматографической колонки. В связи с этим рекомендуется проведение фильтрации до и после насоса.

Хроматографическая колонка. Для каждого белка выбор колонки осуществляется эмпирически. Колонки с размером пор от 10 нм до 30 нм, заполненные сорбентом на основе силикагеля, могут обеспечить оптимальное разделение. Для небольших пептидов неподвижные фазы силикагель октилсилильный для хроматографии P (3 - 10 мкм) и силикагель октадецилсилильный для хроматографии P (3 - 10 мкм) в качестве наполнителей колонки являются более эффективными, чем силикагель бутилсилильный для хроматографии P (5 - 10 мкм).

Растворитель. Наиболее часто используемым растворителем является вода с ацетонитрилом в качестве органического модификатора с добавлением не более 0,1% трифторуксусной кислоты. При необходимости, для солюбилизации компонентов гидролизата, добавляют пропанол или 2-пропанол, при условии, что их добавление не приведет к чрезмерному повышению вязкости компонентов.

Подвижная фаза. Подвижная фаза, содержащая фосфатный буфер, используется для обеспечения возможности выбора pH, поскольку изменение pH в интервале от 3,0 до 5,0 улучшает разделение пептидов, содержащих кислотные остатки (например, глутаминовая и аспарагиновая кислоты). Натрия или калия фосфаты, ацетат аммония, фосфорная кислота при значении pH между 2 и 7 (или выше при использовании полимерного наполнителя) используются с ацетонитрильным градиентом. Достаточно часто используется ацетонитрил с трифторуксусной кислотой.

Градиент. Градиент может быть линейным, нелинейным или включать ступенчатое изменение состава. Для разделения сложных смесей рекомендуется пологий градиент. Градиент оптимизируют, добиваясь четкого разрешения с 1 или 2 пиков, которые становятся "маркерными" пиками для испытания.

Изократическое элюирование. Изократическая ВЭЖХ с использованием подвижной фазой постоянного состава используется ввиду ее удобства и улучшенного аналитического сигнала детектора. В ряде случаев сложно подобрать оптимальный состав подвижной фазы, позволяющий добиться хорошего разрешения для каждого пика. Для проведения изократической ВЭЖХ не должны использоваться подвижные фазы, для которых незначительное изменение в соотношении компонентов или в значении pH существенно влияет на время удерживания пиков на пептидной карте.

Другие параметры. Для достижения хорошей воспроизводимости, как правило, требуется контроль температуры колонки. Скорость подвижной фазы варьируется от 0,1 мл/мин до 2,0 мл/мин, детектирование пептидов осуществляется спектрофотометрическим детектором при длине волны от 200 нм до 230 нм. Используются и другие методы детектирования (например, постколоночная дериватизация), но они не столь надежны и универсальны, как детектирование в ультрафиолетовой области.

Валидация. В данном разделе приводятся экспериментальные средства для оценки общих характеристик используемого метода. Критерии оценки пригодности системы зависят от определения критических параметров испытания, влияющих на интерпретацию данных и их приемлемость. Критические параметры являются также критериями, по которым производится контроль расщепления и анализа пептидов. Для контроля полноты требуемого расщепления используется сравнение со стандартным образцом, который был подвергнут такому же воздействию, как и испытуемый белок. Использование стандартного образца параллельно с испытуемым белком является критическим при разработке и установлении значений критериев оценки пригодности системы. Кроме этого, с целью дополнительного сравнения включается образец хроматограммы стандартного образца. Другие показатели могут включать визуальный контроль растворимости белка или пептидов, отсутствие интактного белка, измерение откликов трудно расщепляемых пептидов. Критические параметры оценки пригодности системы для пептидного анализа будут зависеть от конкретного используемого метода разделения и детектирования, а также требований к получаемым в результате анализа данным.

В случае, когда пептидное картирование используется в качестве испытания по идентификации, требования к пригодности системы для идентифицируемых пептидов включают избирательность и воспроизводимость. В этом случае, как и в случае идентификации отличающихся по составу белков, определение первичной структуры пептидных фрагментов при картировании обеспечивает как верификацию известной первичной структуры, так и идентификацию структуры отличающихся белков путем сравнения с пептидной картой стандартного образца для белка установленной структуры. Использование подвергнутого расщеплению стандартного образца при определении разделения пептидов и аминокислот является референтным методом. Для анализа отличающихся по составу белков может быть использована охарактеризованная по составу смесь отличающегося белка и стандартного образца, в особенности если отличные по составу белки находятся в зоне худшего разрешения на пептидной карте. Критерием выбора системы определения структуры белка может являться число основных определяемых пептидов. Критерии выбора системы для определения структуры белка лучшим образом определяются разрешением пиков пептидов. Хроматографические параметры, такие как разрешение между пиками, ширина пика у основания, площадь пика, степень размывания заднего фронта пика и эффективность колонки, могут быть использованы для определения разрешения пептидов. В зависимости от испытуемого белка и используемого метода разделения могут устанавливаться требования к разрешению одного или нескольких пептидов.

Повторный анализ продуктов расщепления стандартного образца для испытуемого белка позволяет установить количественные характеристики прецизионности и открываемости. Открываемость определяемых пептидов в целом устанавливается при помощи внутренних и внешних пептидных стандартов. Прецизионность выражается как относительное стандартное отклонение. Следует ожидать различий в извлечении и воспроизводимости идентифицируемого протеина; следовательно, критерии допуска для оценки пригодности системы должны быть установлены как для извлечения, так и для воспроизводимости идентифицируемых пептидов. Установленные критерии допуска являются специфическими для данного протеина и указываются в частной фармакопейной статье.

Визуальное сравнение относительных времен удерживания, параметров пиков (площади пика или высоты пика), числа пиков и в целом метода элюирования производится изначально. Оно дополняется и подтверждается математическим анализом соотношений анализируемых параметров пиков и хроматографического профиля смеси 1:1 (об/об) продуктов расщепления испытуемого образца и образца сравнения. Идентичность анализируемого образца подтверждается, если все пики продуктов расщепления анализируемого белка и стандартного образца имеют аналогичные времена удерживания и соотношения оцениваемых параметров пиков.

Если пики, которые изначально характеризовались значительно различающимися относительными временами удерживания, затем в смеси 1:1 обнаруживались единым пиком, изначально выявленное различие является показателем нестабильности системы. Однако если в смеси 1:1 наблюдаются разделенные пики, это является доказательством наличия различных пептидов в каждом из пиков. Если пик в смеси 1:1 существенно шире, чем соответствующий пик в анализируемом белке и стандартном образце, это может означать наличие различных пептидов. Было предложено использование компьютерной программы распознавания для анализа данных пептидного картирования, однако аспекты валидации компьютерной программы исключают ее использование в качестве справочного теста в ближайшем будущем. Использовались также иные автоматизированные подходы с использованием математических формул, моделей и систем распознавания. Одним из таких подходов, например, является автоматическое определение соединений методом ИК-спектроскопии и применение диодно-матричного УФ-спектрального анализа для идентификации пептидов. Данные методы имеют ограничения, обусловленные недостаточным разрешением, одновременным элюированием фрагментов, различиями в абсолютных значениях параметров пиков между продуктами расщепления анализируемого и стандартных образцов.

Можно произвести множественное сравнение времен удерживания и площадей или высоты пиков для выбранной группы соответствующих пиков, которые правильно идентифицируются на пептидной карте. Площади пиков могут быть рассчитаны с использованием одного пика, демонстрирующего относительно небольшую вариабельность в качестве внутреннего стандарта, с учетом того, что интегрирование площади пика является чувствительным к базовой вариабельности и может служить причиной ошибки анализа. Как альтернативный вариант для испытуемого образца может быть рассчитан процент высоты пика каждого пептида относительно суммы высоты всех пиков. Затем полученный процент сравнивается со значением аналогичного параметра соответствующего пика стандартного образца. Возможность автогидролиза трипсина контролируется при помощи создания пептидной карты-плацебо, получаемой при обработке трипсином раствора без определяемого белка.

Минимальным требованием для оценки качества пептидного картирования является принятая процедура тестирования, которая включает пригодность системы в качестве контроля. В целом на начальном этапе регуляторного процесса качественный анализ пептидной карты анализируемого белка является достаточным. С усовершенствованием процесса регуляторного одобрения белков дополнительные испытания по оценке качества могут включать частичную валидацию аналитической процедуры для обеспечения гарантии того, что метод будет произведен в соответствии с запланированным при разработке пептидной карты определяемого белка.