МЕТОД 9

Восстановление и алкилирование цистеина/цистина происходит при карбоксиметилировании в жидкой фазе.

Исходные растворы. Готовят как указано в Методе 8.

Раствор для карбоксиметилирования. Готовят раствор 100 г/л йодацетамида в 96% спирте.

Буферный раствор. Используют восстанавливающий раствор, приготовленный как указано в Методе 8.

Методика. Испытуемый образец растворяют в 50 мкл буферного раствора и прибавляют около 2,5 мкл исходного раствора C. Выдерживают при комнатной температуре в защищенном от света месте в атмосфере азота или аргона в течение 2 ч. Прибавляют раствор для карбоксиметилирования в 1,5-кратном количестве от общего теоретического содержания тиолов, и выдерживают дополнительно в течение 30 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте. Если содержание тиолов в белке неизвестно, прибавляют 5 мкл 0,1 M раствора йодацетамида на каждые 20 нмоль испытуемого образца белка. Для прекращения реакции прибавляют избыток 2-меркаптоэтанола. Обессоливают белок/пептид методом обращенно-фазовой ВЭЖХ, собирая белковую/пептидную фракцию. Перед кислотным гидролизом собранный образец может быть высушен при помощи вакуумного центрифугирования. В процессе кислотного гидролиза полученный S-карбоксиамидометилцистеин будет превращаться в S-карбоксиметилцистеин.