ПРОБОПОДГОТОВКА

Концентрация остаточной ДНК клетки-хозяина существенно зависит от вида биотехнологического лекарственного средства, от технологии при его создании и степени очистки от ДНК в производственном процессе.

В зависимости от матрицы для достижения надлежащей открываемости остаточной ДНК клетки-хозяина может понадобиться предварительная обработка образца.

Для анализа белков высокой степени очистки, таких как рекомбинантные белки или моноклональные антитела, необходимая величина открываемости остаточной ДНК клетки-хозяина может быть достигнута с использованием обычного протеолитического расщепления или аффинной хроматографии. Для более сложной матрицы (например, вирусной вакцины или вирусного вектора) для высвобождения остаточной ДНК из вирусных частиц может потребоваться дополнительная стадия лизиса вируса.

Метод иммуноферментного анализа особенно чувствителен к интерферирующему воздействию белков, избежать которого можно, используя расщепление протеиназой K и натрия додецилсульфатом в качестве первоначальной стадии предварительной обработки образца. Этого может быть достаточно для достижения необходимой открываемости остаточной ДНК клетки-хозяина. В некоторых случаях остаточная ДНК клетки-хозяина может быть связана с компонентами испытуемого образца, в котором также могут присутствовать растворимые мешающие вещества, в этом случае может понадобиться выделение остаточной ДНК клетки-хозяина из испытуемого образца.

Для выделения ДНК используют процедуры, при которых получена удовлетворительная величина открываемости в экспериментах с добавками. Существует несколько подходящих методов выделения, включая преципитацию ДНК или ДНК-специфическое связывание с матрицей (например, магнитными шариками или колонками с диоксидом кремния). Для выделения остаточной ДНК клетки-хозяина можно использовать коммерчески доступные наборы. В некоторых наборах для разрушения связи между остаточной ДНК клетки-хозяина и компонентами испытуемого образца используют хаотропные агенты (натрия йодид и др.) и детергент (натрия лаурилсаркозинат). Остаточную ДНК клетки-хозяина извлекают из испытуемого образца путем соосаждения с молекулой-носителем, такой как гликоген, в присутствии этанола или 2-пропанола. В зависимости от воспроизводимости результатов по проверке открываемости добавки может потребоваться несколько независимых процедур выделения. В каждую процедуру выделения должны быть включены отрицательные контроли. В некоторых случаях рекомендуется разведение полученных образцов (извлеченные пробы) для уменьшения эффекта матрицы. Также может быть применен поправочный коэффициент, учитывающий открываемость добавки.

Таблица 2.1.6.19.-1. - Сравнение методов кПЦР-РВ (метод 1) и иммуноферментного анализа (метод 2)