ОПТИМИЗАЦИЯ

Основными параметрами, которые следует учитывать при разработке методик разделения, являются следующие.

Напряжение. В капиллярном изоэлектрическом фокусировании на стадии фокусирования используется электрическое поле с очень высокой напряженностью - от 300 В/см до 1000 В/см.

Капилляр. В зависимости от способа мобилизации (см. выше) электроосмотический поток должен быть уменьшен или подавлен. Капилляры с модифицированной поверхностью, как правило, уменьшают электроосмотический поток.

Растворы. Резервуар с анодным буферным раствором заполняют раствором, значение pH которого меньше значения pI большинства кислотных амфолитов, а катодный резервуар - раствором, значение pH которого больше значения pI большинства основных амфолитов. Для анодных буферных растворов часто используют фосфорную кислоту, а для катодных - натрия гидроксид.

Добавление полимера, такого как метилцеллюлоза, в раствор амфолита приводит к подавлению конвективных сил (если такие имеются) и электроосмотического потока, что обусловлено увеличением вязкости. Имеющиеся в продаже амфолиты покрывают множество диапазонов pH, а при необходимости для получения более широкого диапазона pH их можно смешивать. Широкие диапазоны pH используются для оценки величины изоэлектрической точки, в то время как более узкие применяются для улучшения точности анализа. Для калибровки можно использовать зависимость между временем миграции и изоэлектрической точкой для серии белковых маркеров. При необходимости, осаждение белков в изоэлектрической точке во время стадии фокусирования может быть предотвращено добавлением к буферному раствору глицерина, поверхностно-активных веществ, мочевины или цвиттер-ионных буферных растворов. Следует иметь в виду, что мочевина в зависимости от концентрации денатурирует белки.