5-5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ

Молекулярные массы белков определяют, сравнивая их подвижность с подвижностью нескольких маркерных белков с известной молекулярной массой. Для калибровки гелей доступны смеси из предварительно окрашенных и неокрашенных белков с точно известными молекулярными массами, смешанными для равномерного окрашивания. Получены смеси для различных диапазонов молекулярных масс. Концентрированные растворы белков с известной молекулярной массой разводят соответствующим буфером образца и наносят на тот же гель, что и испытуемый образец.

Сразу после проведения электрофореза отмечают положение полосы красителя бромфенолового синего, которая соответствует передней кромке электрофоретического ионного фронта. Это можно сделать нанесением надреза края геля или путем прокола геля в зоне окрашенного геля иглой, предварительно смоченной в черную тушь или другой подходящий контрастный краситель. После окрашивания геля измеряют пробег для каждой полосы белка (маркеров или испытуемого образца) от вершины разрешающего геля. Вычисляют отношение расстояние пробега каждого белка к расстоянию пробега, пройденного красителем. Нормализованные расстояния пробега, вычисленные таким образом, называются относительными подвижностями белков (относительно фронта красителя) и обозначаются, как R_F. Строят график зависимости логарифма относительных молекулярных масс (М.м.) белковых стандартных образцов от полученных значений R_F. Неизвестные молекулярные массы определяют с помощью метода линейной регрессии (для получения более точного результата - методом нелинейной регрессии) или интерполяцией кривых зависимости log M_r от R_F, если значения, полученные для испытуемых образцов, располагаются на линейной части графика.