5-1-2. ДЕНАТУРИРУЮЩИЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ

Данный метод позволяет анализировать мономеры полипептидов с молекулярной массой от 14 000 до 100 000 дальтон. Возможно расширение границ молекулярных масс с использованием различных методик (например, путем использования градиентных гелей, определенных буферных систем). Например, трицин-ПААГ гели, содержащие трицин в качестве отстающего иона в разделяющем буферном растворе для электрофореза (вместо глицина, как в методе, описанном выше), позволяют разделять очень маленькие белки и пептиды от менее 10 000 до 15 000 дальтон.

Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле с использованием натрия додецилсульфата (ДСН-ПААГ) является наиболее общепринятым методом электрофореза, который используется для оценки качества белков в фармацевтической продукции и описан ниже в качестве примера указанного метода. Как правило аналитический электрофорез белков проводят в полиакриламидных гелях в условиях, обеспечивающих их диссоциацию на отдельные полипептидные субъединицы и минимизирующих агрегацию. Чаще всего перед нанесением на гель белки подвергают диссоциации нагреванием с сильным анионным детергентом - натрия додецилсульфатом (ДСН). Денатурированные полипептиды связываются с ДСН, превращаясь в отрицательно заряженные частицы с постоянным отношением массы к заряду независимо от типа белка. Поскольку количество связанного ДСН почти всегда пропорционально молекулярной массе полипептида и не зависит от его последовательности, ДСН-полипептидные комплексы мигрируют в полиакриламидном геле со скоростью, зависящей от размера полипептида.

Электрофоретическая подвижность полученных детергент-полипептидных комплексов находится в функциональной взаимосвязи с их молекулярными массами. Миграция ДСН-комплексов происходит в направлении к аноду, при этом комплексы с низкими молекулярными массами движутся быстрее, чем с большими молекулярными массами. Следовательно, молекулярная масса белка может быть определена по его относительной подвижности в калиброванном ДСН-ПААГ, а наличие единичной полосы в геле является критерием чистоты белка.

Модификации полипептидной цепи, например, N- или O-связанное гликозилирование, приводят к значительному влиянию на кажущуюся среднюю молекулярную массу белка, поскольку ДСН не связывается с углеводным компонентом так же, как с полипептидным. В этом случае постоянное отношение заряда к молекулярной массе не сохраняется.

В зависимости от степени гликозилирования и других посттрансляционных модификаций средняя молекулярная масса белков не может быть истинным отражением массы полипептидной цепи.

Восстанавливающие условия. Полипептидные субъединицы и трехмерная структура белков часто поддерживаются благодаря присутствию дисульфидных связей. Цель анализа ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях состоит в том, чтобы разрушить структуру белков расщеплением дисульфидных связей. Полная денатурация и диссоциация белков обработкой 2-меркаптоэтанолом или дитиотреитолом (ДТТ) приводит к разворачиванию полипептидной цепи и последующему комплексообразованию с ДСН. В этих условиях молекулярную массу полипептидных субъединиц можно рассчитать методом линейной регрессии (для получения более точного результата - методом нелинейной регрессии) при использовании подходящих стандартов молекулярных масс.

Невосстанавливающие условия. Для ряда испытаний полная диссоциация белка на полипептидные субъединицы нежелательна. В отсутствие обработки восстанавливающими агентами, такими, как 2-меркаптоэтанол или ДТТ, дисульфидные ковалентные связи остаются неповрежденными и разделения на полипептидные субъединицы не происходит. Олигомерные ДСН-белковые комплексы мигрируют медленнее, чем их ДСН-полипептидные субъединицы. Кроме того, невосстановленные белки не могут быть целиком насыщены ДСН и, соответственно, поэтому не могут связывать детергент в постоянном массовом отношении. Дисульфидные связи внутри цепи укрепляют структуру полипептида, обычно посредством уменьшения гидродинамического радиуса молекулы, и таким образом уменьшая кажущуюся среднюю молекулярную массу. В связи с этим, определение молекулярной массы этих молекул с использованием ДСН-ПААГ является менее стандартизованным, чем анализ полностью денатурированных полипептидов, так как необходимо, чтобы и стандарты и анализируемые белки имели бы одинаковые конфигурации для достоверного сравнения.