Стадия 2

Затем в отдельные кварцевые пробирки вводят по 2,0 мл испытуемых растворов (а) и (б), полученных на этапе 1. Для испарения растворителя через растворы пропускают слабый поток азота P. Добавляют 1,5 мл натрия гидроксида раствор P (20 г/л) в метаноле P, создают над раствором прослойку азота P, плотно закрывают пробкой ламинированною политетрафторэтиленом, тщательно перемешивают и нагревают на водяной бане в течение 7 мин. Оставляют для охлаждения.

В остывшие пробирки добавляют 2 мл раствора бора трихлорида в метаноле P, вновь создают прослойку азота P, плотно закрывают пробкой, тщательно перемешивают и нагревают на водяной бане в течение 30 мин. Охлаждают до 40 - 50 °C. Добавляют 1 мл триметилпентана P, покрывают слоем азота P, закрывают пробкой и энергично перемешивают не менее 30 с. Немедленно добавляют 5 мл натрия хлорида насыщенный раствор P, покрывают азотом P, закрывают пробкой и тщательно перемешивают не менее 15 с. Переносят количественно верхний слой в отдельную пробирку. В оставшийся раствор добавляют 1 мл триметилпентана P, перемешивают и повторяют перенос. Объединенные экстракты триметилпентана промывают двумя порциями воды P по 1 мл и высушивают над натрия сульфат безводный P. Для высушивания на дно эксикатора помещают натрия сульфат безводный P, сверху устанавливают решетку, на которой размещают открытые пробирки, плотно закрывают эксикатор и выдерживают до появления сухого остатка.

Растворы сравнения: растворы сравнения (а₁) и (а₂) готовят в двух повторностях; раствор сравнения (в) готовят только для триглицеридов в том случае, если на хроматограмме испытуемого раствора (а) явно не обнаруживается пик метилового эфира тетракоз-15-еновой кислоты.

- раствор сравнения (аф Растворяют 70,0 мг внутреннего стандарта и 90,0 мг СО ФЕАЭС этилового эфира эйкозапентаеновой кислоты в растворе 50 мг/л бутилгидрокситолуола P в триметилпентане P и доводят объем тем же раствором до 10,0 мл. Для растворения внутреннего стандарта допускается слабое нагревание до 60 °C.

- раствор сравнения (а₂). 60,0 мг СО ФЕАЭС этилового эфира докозагексаеновой кислоты и 70,0 мг внутреннего стандарта растворяют в растворе 50 мг/л бутилгидрокситолуола P в триметилпентане P и доводят объем тем же раствором до 10,0 мл. Для растворения внутреннего стандарта допускается слабое нагревание до 60 °C. Для определения этиловых эфиров растворы сравнения (а₁) и (а₂) готовы. Для определения триглицеридов, продолжить стадию 2 таким же образом, как для испытуемых образцов (а) и (б).

- раствор сравнения (б). 0,300 г метиларахидата P, 0,300 г метилбегената P, 0,300 г метилпальмитата P и 0,300 г метилстерата P растворяют в растворе 50 мг/л бутилгидрокситолуола P в триметилпентане P и доводят объем тем же раствором до 10,0 мл;

- раствор сравнения (в). Навеску, содержащую 55,0 мг метилового эфира докозагексаеновой кислоты P и 5,0 мг метилового эфира тетракоз-15-еновой кислоты P растворяют в растворе 50 мг/л бутилгидрокситолуола P в триметилпентане P и доводят объем тем же раствором до 10,0 мл.

Условия хроматографирования:

- колонка: капиллярная, из термостойкого кварца длиной не менее 25 м и внутренним диаметром 0,25 мм покрытая макроголом 20 000 P толщиной 0,2 мкм;

- газ-носитель: водород для хроматографии P или гелий для хроматографии P;

- скорость газа-носителя: 1 мл/мин;

- детектор: пламенно-ионизационный;

- объем вводимой пробы: 1 мл;

- деление потока: 1:200, в качестве альтернативы - введение без деления потоков с контролем температуры (в этом случае необходимо перед введением испытуемые растворы развести 1/200 раствором 50 мг/л бутилгидрокситолуола P в триметилпентане P).

При необходимости корректируют скорость потока и (или) разведение образца таким образом, чтобы достигнуть коэффициента симметрии 0,8 - 1,5 для пиков метиловых или этиловых эфиров эйкозапентаеновой кислоты и докозагексаеновой кислоты, при этом на хроматограмме испытуемого раствора (б) должны отчетливо обнаруживаться пики, относящиеся к соответствующим эфирам (линоленовой кислоты (C18:3 n-3), стеаридоновой кислоты (C18:4 n-3), эйкозатетраеновой кислоты (C20:4 n-3), геникозапентаеновой кислоты (C21:5 n-3) и докозапентаеновой кислоты (C22:5 n-3)). В случае невыполнения требований, приоритет имеют четкие обнаружения соответствующих сложных эфиров, представленных выше для испытуемого раствора (б).

При необходимости, для получения коэффициента симметрии 0,8 - 1,5 для пиков, обусловленных компонентами раствора сравнения (б), корректируют скорость потока и (или) разбавление образца.

- режим изменения температуры:

--------------------------------

<*> 90 °C при введении непосредственно в начало колонки.

Пригодность хроматографической системы:

- на хроматограмме раствора сравнения (б) площади пиков компонентов метилпальмитата, метилстеарата, метиларахидата и метилбегената изменяются в соответствии с коэффициентами чувствительности, представленными в таблице 2.1.8.25.-2 (площадь пика умножается на коэффициент чувствительности); после применения метода нормализации, откорректированные площади пиков метиловых эфиров жирных кислот принимают за 100 процентов; нормализированное процентное содержание площади каждого метилового эфира жирной кислоты должны быть в пределах (+/- 1) процента от соответствующего массового процента;

Таблица 2.1.8.25.-2.

- разрешение:

- этиловые эфиры: не менее 1,2 между пиками метилтрикозаноата и этилового эфира геникозапентаеновой кислоты на хроматограмме раствора сравнения (а);

- триглицериды: не менее 1,2 между пиками метилового эфира докозагексаеновой кислоты и метилового эфира тетракоз-15-еновой кислоты на хроматограмме испытуемого раствора (а) или раствора сравнения (в);

- на хроматограмме, полученной с помощью испытуемого раствора (а), пики метилтрикозаноата и метилового эфира геникозапентаеновой кислоты при сравнении с хроматограммой, полученной с помощью испытуемого раствора (б) должны быть полностью разделены.

Содержание эйкозапентаеновой кислоты и докозагексаеновой кислоты в процентах с учетом их содержания в стандартных образцах рассчитывают по формуле:

,

где: R_f - коэффициент чувствительности для эйкозапентаеновой кислоты и докозагексаеновой кислоты, рассчитанный по формуле:

,

где: m₁ - масса внутреннего стандарта в испытуемом растворе (а) в миллиграммах;

m₂ - масса испытуемого образца в испытуемом растворе (а) в миллиграммах;

m_x,₃ - масса внутреннего стандарта в растворе сравнения (а) (для определения эйкозапентаеновой кислоты) или в растворе сравнения (а₂) (для определения докозагексаеновой кислоты), в миллиграммах;

m_x,_r - масса СО ФЕАЭС этилового эфира эйкозапентаеновой кислоты в растворе сравнения (а₁) или СО ФЕАЭС этилового эфира докозагексаеновой кислоты в растворе сравнения (а₂), в миллиграммах;

A_x - площадь пика этилового эфира эйкозапентаеновой кислоты или этилового эфира докозагексаеновой кислоты на хроматограмме испытуемого раствора (а);

A_x,_r - площадь пика этилового эфира эйкозапентаеновой кислоты на хроматограмме раствора сравнения (а₁) или этилового эфира докозагексаеновой кислоты на хроматограмме раствора сравнения (а₂);

A₁ - площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме испытуемого раствора (а);

A_x,₃ - площадь пика внутреннего стандарта на хроматограммах раствора сравнения (а₁) (для определения эйкозапентаеновой кислоты) или раствора сравнения (а₂) (для определения докозагексаеновой кислоты);

К - коэффициент пересчета между этиловыми эфирами и триглицеридами:

Этиловые эфиры К - 1,00;

Триглицериды К - 0,954 для эйкозапентаеновой кислоты;

К - 0,957 для докозагексаеновой кислоты.