РУЧНОЙ МЕТОД

Принцип испытания

Испытание основано на проницаемости цитоплазматических мембран: нежизнеспособные (мертвые или поврежденные клетки) абсорбируют краситель и окрашиваются, жизнеспособные клетки не окрашиваются. Испытание дает информацию о целостности мембраны, но его результаты не обязательно отражают функциональную активность клетки. Мембраны недавно трипсинизированных или размороженных жизнеспособных клеток способны абсорбировать краситель.

Краситель

Наиболее часто используемым красителем для определения жизнеспособности клеток, является трипановый синий, но также могут быть использованы и другие подходящие красители, такие как эритрозин B или нигрозин.

Трипановый синий - кислотный краситель (M_r 961), анион с четырьмя сульфонатными группами, легко связывающимися с белками, поэтому концентрация белка в испытуемом образце должна быть настолько низкой, насколько возможно.

Условия проведения испытания

Фиксация окраски клеток сильно зависит от значения pH, поэтому необходимо проведение окрашивания при pH в пределах от 6,6 до 7,6. Оптимальная фиксация осуществляется при значении pH 7,5. Другие условия, такие как концентрация красителя и время окрашивания, должны быть валидированы.

Условия хранения красителя. Обычно используют 0,4% или 0,5% раствор трипанового синего в стерильном подходящем фосфатно-солевом буферном растворе. Хранят в защищенном от воздействия света и воздуха месте.

Подготовка к испытанию и анализ. Суспензию клеток, разведенную до необходимой концентрации в подходящем фосфатно-солевом буферном растворе, окрашивают, например, с использованием раствора трипанового синего с конечной концентрацией от 0,1% до 0,2%. Аккуратно перемешивают. Инкубируют не более 2 - 4 мин при комнатной температуре. Вновь аккуратно перемешивают, помещают подходящий объем в счетную камеру и проводят подсчет клеток.

Определяют процент жизнеспособных клеток как отношение числа неокрашенных клеток к общему количеству клеток, подсчитанному с использованием оптического микроскопа, считая все окрашенные клетки нежизнеспособными.

Жизнеспособность клеток (V) в процентах рассчитывают по формуле:

где: n - число неокрашенных (жизнеспособных) клеток;

N - общее количество клеток (окрашенных и неокрашенных).

Время инкубации не должно превышать 4 мин, так как впоследствии число окрашенных клеток может значительно увеличиться. В связи с этим для повторного определения необходимо подготовить новый образец.