МЕТОДИКА

Испытуемые растворы. Лиофильно высушенные лекарственные препараты восстанавливают в соответствии с инструкцией по медицинскому применению. Готовят не менее трех полутора- или двукратных разведений, начиная с концентрации в диапазоне 1,2 - 0,15 МЕ/мл, с использованием ФСБ-БСА не менее чем в трех повторностях. При необходимости исходное разведение корректируют с целью получения эффектов, попадающих в линейную область графика зависимости "доза - ответ".

Растворы сравнения. Восстанавливают стандартный образец (например, СО ФЕАЭС иммуноглобулина анти-D человека) в соответствии с указаниями производителя. Готовят не менее трех полутора- или двукратных разведений, начиная с концентрации в диапазоне 1,2 - 0,15 МЕ/мл, с использованием ФСБ-БСА не менее чем в трех повторностях. При необходимости исходное разведение корректируют с целью получения эффектов, попадающих в линейную область графика зависимости "доза - ответ".

В каждую лунку титрационного микропланшета вносят по 50 мкл D-положительных эритроцитов. К содержимому каждой серии лунок прибавляют по 50 мкл соответствующего разведения испытуемого образца или стандартного образца. В качестве отрицательного контроля в серию соответствующих лунок прибавляют по 50 мкл ФСБ-БСА. Для контроля неспецифического связывания вносят по 50 мкл D-отрицательных эритроцитов в свободные лунки того же микропланшета и к содержимому каждой серии лунок прибавляют по 50 мкл наименьшего разведения испытуемого образца или стандартного образца. В качестве отрицательного контроля в серию соответствующих лунок, содержащих по 50 мкл D-отрицательных эритроцитов, вносят по 50 мкл ФСБ-БСА. Запечатывают пластиковой пленкой и инкубируют при температуре 37 °C в течение 40 мин.

Планшет центрифугируют при 50 g в течение трех минут, удаляют надосадочную жидкость и промывают лунки 200 - 250 мкл ФСБ-БСА. Планшеты промывают не менее двух раз. Планшеты центрифугируют при 50 g в течение трех минут, удаляют надосадочную жидкость и прибавляют по 50 мкл раствора вторичного антитела, полученного разведением с помощью ФСБ-БСА до подходящей концентрации (рабочий титр вторичных антител заранее устанавливают опытным путем). Запечатывают полимерной пленкой и инкубируют при температуре от 15 °C до 25 °C в защищенном от света месте в течение 20 мин.

По окончании инкубации с вторичными антителами планшет отмывают не менее двух раз путем центрифугирования при 50 g в течение трех минут с 200 - 250 мкл ФСБ. Удаляют надосадочную жидкость и ресуспендируют эритроциты в 200 - 250 мкл ФСБ.

Суспензию клеток переносят в подходящие пробирки, совместимые с моделью проточного цитофлуориметра. При необходимости, для обеспечения подходящей скорости потока объем полученных образцов доводят ФСБ до оптимального значения.

Накопление данных производят не позднее 20 мин от окончания пробоподготовки. Для статистического анализа накапливают не менее 10 000 событий без выхода за пределы установленного порогового значения какого-либо параметра с исключением нецелевых (дебрисных) включений (в том числе мертвых клеток). Учитывают медианную интенсивность флуоресценции и процент положительных клеток. С использованием значения медианной интенсивности флуоресценции в линейной области кривой зависимости "доза - ответ" рассчитывают активность испытуемого образца общепринятыми статистическими методами (2.3.12.0).

201110006-2023