ПРИНЦИП

При изоэлектрическом фокусировании молекулы мигрируют под влиянием электрического поля до тех пор, пока они остаются заряженными в градиенте pH, создаваемом амфолитами, имеющими широкий диапазон значений pI (полиаминокарбоновые кислоты), растворенными в буферном растворе. Тремя основными стадиями изоэлектрического фокусирования являются загрузка, фокусирование и мобилизация.

Стадия загрузки. Могут быть использованы два способа:

- одноступенчатая загрузка: проба смешивается с амфолитами и вводится в капилляр под давлением или с помощью вакуума;

- последовательная загрузка: в капилляр вводят сначала ведущий буферный раствор, затем амфолиты, затем пробу, смешанную с амфолитами, после чего снова амфолиты и в конце замыкающий буферный раствор. Объем пробы должен быть небольшим, чтобы не повлиять на величину градиента pH.

Стадия фокусирования. При наложении напряжения амфолиты, в зависимости от своего суммарного заряда, мигрируют по направлению к катоду или аноду, тем самым создавая градиент от анода (более низкие значения pH) к катоду (более высокие значения pH). На данной стадии разделяемые компоненты мигрируют до тех пор, пока не достигнут значения pH, соответствующего своей изоэлектрической точке (pI) и ток не упадет до очень низких значений.

Стадия мобилизации. Если для детектирования необходима мобилизация, используют один из следующих способов:

- в первом способе мобилизация проводится в течение стадии фокусирования вследствие действия электроосмотического потока; электроосмотический поток должен быть достаточно малым, чтобы позволить провести фокусирование компонентов;

- во втором способе мобилизация проводится после стадии фокусирования путем использования положительного давления;

- в третьем способе мобилизация проводится после стадии фокусирования путем добавления солей в катодный или анодный резервуар (в зависимости от направления, выбранного для мобилизации) для изменения pH в капилляре при наложении напряжения. Поскольку pH изменяется, белки и электролиты перемещаются по направлению к резервуару, который содержит добавленные соли, и проходят через детектор.

Достигаемое разделение, выраженное как , зависит от градиента pH (dpH / dx), количества амфолитов, имеющих различные величины pI, коэффициента молекулярной диффузии (D), напряженности электрического поля (E) и изменения электрофоретической подвижности определяемого вещества при изменении pH :

.