МЕТОД 11

Аспарагин и глутамин в процессе кислотного гидролиза превращаются в аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту, соответственно. Остатки аспарагина и аспарагиновой кислоты обозначают как Asx, а остатки глутамина и глутаминовой кислоты обозначают как Glx. Белки/пептиды могут взаимодействовать с бис(1,1-трифторацетокси)йодбензолом (БТЙ), превращая при гидролизе остатки аспарагина и глутамина в остатки диаминопропионовой кислоты и диаминомасляной кислоты, соответственно. Эти превращения позволяют определять в белке/пептиде содержание аспарагина и глутамина в присутствии остатков аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты.

Восстанавливающие растворы. Готовят и фильтруют 3 раствора: 0,01 M раствор трифторуксусной кислоты (раствор A); 5 M раствор гуанидина гидрохлорида, содержащий 0,01 M трифторуксусной кислоты (раствор B); свежеприготовленный раствор диметилформамида, содержащий 36 мг/мл БТЙ (раствор C).

Методика. Около 200 мкг испытуемого образца помещают в чистую ампулу для гидролиза и прибавляют 2 мл раствора A или раствора B и 2 мл раствора C. Ампулу для гидролиза герметично запаивают в вакууме. Испытуемый образец нагревают при температуре 60 °C в течение 4 ч в защищенном от света месте. Затем образец подвергают диализу водой для удаления избытка реактивов. Диализированный образец трижды экстрагируют равными объемами бутилацетата и лиофилизируют. Белок может быть затем гидролизован согласно описанной ранее методике. Остатки , кислоты и , кислоты обычно не отделяются от остатков лизина ионообменной хроматографией, используемой при аминокислотном анализе. Таким образом, при использовании ионного обмена для разделения при аминокислотном анализе содержание аспарагина и глутамина представляет собой разницу между количественным содержанием аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты, полученным при кислотном гидролизе без дериватизации и с BTI-дериватизацией. Количественное содержание треонина, метионина, цистеина, тирозина и гистидина может изменяться при БТЙ-дериватизации; при необходимости определения этих аминокислотных остатков белка/пептида следует проводить гидролиз без БТЙ-дериватизации.