5-1-4. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ВЕРТИКАЛЬНЫХ ПРЕРЫВИСТО-БУФЕРНЫХ ДСН-ПОЛИАКРИЛАМИДНЫХ ГЕЛЕЙ

Данный раздел описывает приготовление гелей с использованием специального инструментария. Это не относится к сборным гелям. В случае применения предварительно приготовленных или любых других коммерчески доступных гелей и иного оборудования необходимо руководствоваться инструкциями производителя. Рекомендуется использовать коммерчески доступные реактивы, очищенные в растворе. В ином случае, а также при использовании недостаточно очищенных реактивов, проводят предварительную обработку. Например, раствор, имеющий такую степень загрязнения, что его необходимо фильтровать, должен быть также деионизирован с использованием ионообменной смолы смешанного типа (катионообменной/анионообменной) для удаления акриловой кислоты и других заряженных продуктов разложения. Растворы акриламида/бисакриламида и персульфат в твердом состоянии остаются стабильными в течение длительного периода при условии хранения в соответствии с рекомендациями.

Сборка кассет, формирующих гель. Две стеклянные пластинки (например, размером 10 см x 8 см), политетрафторэтиленовую гребенку, две прокладки и силиконовые трубки (например, диаметром 0,6 мм и длиной 35 см) моют с использованием мягких моющих средств и тщательно ополаскивают водой, а затем безводным этанолом и высушивают при комнатной температуре. Прокладки и трубки смазывают несиликоновым маслом. Прокладки укладывают вдоль двух коротких сторон стеклянных пластин на расстоянии 2 мм от их краев и 2 мм от длинной стороны, являющейся дном геля. Используя одну прокладку в качестве основы, начинают укладывать трубку. Осторожно загибают трубку к низу прокладки и протягивают вдоль длинной стороны стеклянной пластинки. Придерживая трубку вдоль длинной стороны пластинки, снова загибают трубку и протягивают ее по короткой стороне стеклянной пластинки, используя прокладку в качестве направляющей. Накрывают другой стеклянной пластинкой, плотно прижимая кассету руками. Устанавливают по два зажима на две короткие стороны кассеты. Осторожно устанавливают четыре зажима на длинную сторону кассеты геля, формируя дно кассеты. Необходимо удостовериться, чтобы трубка проходила вдоль края стеклянной пластинки и нигде не выдавливалась при размещении зажимов. Кассета готова для заливания гелем.

Приготовление геля. В случае приготовления прерывистого буферного ДСН-полиакриламидного геля рекомендуется сначала залить разделяющий гель, дождаться его полимеризации, а затем залить концентрирующий гель, поскольку гели различаются содержанием акриламида-бисакриламида, буферным раствором и pH.

Приготовление разделяющего геля. В конической колбе готовят соответствующий объем раствора с необходимой концентрацией акриламида для формирования разрешающего геля, используя указания, приведенные в таблице 2.1.2.30.-1. Компоненты смешивают в указанной последовательности. При необходимости перед добавлением раствора аммония персульфата и ТЕМЭДа раствор фильтруют под вакуумом через ацетатцеллюлозную мембрану (диаметр пор 0,45 мкм); раствор выдерживают под вакуумом, взбалтывая фильтрационное приспособление до окончания образования в растворе пузырьков. Затем добавляют соответствующее количество раствора аммония персульфата и ТЕМЭДа, как указано в таблице 2.1.2.30.-1, взбалтывают и сразу заливают в пространство между двумя пластинками кассеты. Оставляют необходимое место для концентрирующего геля (длина зубцов гребенки плюс 1 см). Используя заостренную стеклянную пипетку, осторожно наслаивают насыщенный водой раствор изобутанола. Гель выдерживают в вертикальном положении при комнатной температуре до полимеризации геля.

Таблица 2.1.2.30.-1. - Приготовление разделяющего геля

--------------------------------

<1> Раствор акриламида: 30% раствор акриламид-бисакриламида (29:1) P.

<2> 1,5 МТрис (pH 8,8): 1,5 M буферный раствор трис-гидрохлорида pH 8,8 P.

<3> Раствор 100 г/л ДСН: раствор 100 г/л натрия додецилсульфата P.

<4> Раствор 100 г/л АПС: раствор 100 г/л аммония персульфата P. Благодаря аммония персульфату появляются свободные радикалы, ускоряющие полимеризацию акриламида и бисакриламида. Так как раствор аммония персульфата быстро разлагается, свежие растворы следует готовить ежедневно.

<5> ТЕМЭД: тетраметилэтилендиамин P.

Приготовление концентрирующего геля. После завершения полимеризации (около 30 мин) сливают изобутанол и промывают верхнюю поверхность геля несколько раз водой для удаления нанесенного изобутанола и неполимеризованных излишков акриламида. По возможности с верхней поверхности геля сливают воду, а затем удаляют остатки воды при помощи кончика бумажной салфетки.

В конической колбе готовят соответствующий объем раствора с необходимой концентрацией акриламида для формирования геля, используя значения, приведенные в таблице 2.1.2.30.-2. Компоненты смешивают в указанной последовательности. При необходимости перед добавлением раствора аммония персульфата и ТЕМЭДа раствор фильтруют под вакуумом через ацетатцеллюлозную мембрану (диаметр пор 0,45 мкм); раствор выдерживают под вакуумом, встряхивая фильтрационное приспособление до окончания образования в растворе пузырьков. Прибавляют соответствующее количество раствора аммония персульфата и ТЕМЭДа, как указано в таблице 2.1.2.30.-2, взбалтывают и сразу заливают в пространство между двумя стеклянными пластинками кассеты прямо на поверхность ранее заполимеризованного разделяющего геля. Во избежание появления воздушных пузырьков в раствор концентрирующего геля сразу вставляют чистую политетрафторэтиленовую гребенку. Добавляют еще раствор концентрирующего геля до полного заполнения пространства между гребенкой и разделяющим гелем. Гель выдерживают в вертикальном положении при комнатной температуре до полимеризации геля.

Таблица 2.1.2.30.-2. - Приготовление концентрирующего геля

--------------------------------

<1> Раствор акриламида: 30% раствор акриламид/бисакриламида (29:1) P.

<2> МТрис (pH 6,8): 1 M буферный раствор трис-гидрохлорида pH 6,8 P.

<3> Раствор 100 г/л ДСН: раствор 100 г/л натрия додецилсульфата P.

<4> Раствор 100 г/л АПС: раствор 100 г/л аммония персульфата P. Благодаря аммония персульфату появляются свободные радикалы, ускоряющие полимеризацию акриламида и бисакриламида. Поскольку раствор аммония персульфата быстро разлагается, свежие растворы следует готовить ежедневно.

<5> ТЕМЭД: тетраметилэтилендиамин P.

Приготовление образцов. Если иное не указано в частной фармакопейной статье, образцы могут быть приготовлены приведенными ниже способами.

Приготовление образцов (невосстанавливающие условия). Смешивают равные объемы смеси, состоящей из воды P и испытуемого препарата или препарата сравнения, и концентрированного буферного раствора для приготовления образцов при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия P.

Приготовление образцов (восстанавливающие условия). Смешивают равные объемы смеси, состоящей из воды P и испытуемого препарата или препарата сравнения, и концентрированного буферного раствора для приготовления образцов в восстанавливающих условиях при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия P, содержащего 2-меркаптоэтанол (или дитиотреитол) в качестве восстановителя.

Концентрация, указанная в частной фармакопейной статье, может варьировать в зависимости от белка и способа окрашивания.

Обработка образца: образец выдерживают в кипящей водяной бане в течение 5 мин или нагревательном блоке при температуре 100 °C, затем охлаждают. Температура и время, указанные в частной фармакопейной статье могут варьировать в связи с возможным разрушением белка, которое может произойти при термической обработке.

Установка геля в приборе для электрофореза и электрофоретическое разделение. После завершения полимеризации (около 30 мин) политетрафторэтиленовую гребенку осторожно удаляют. Лунки незамедлительно промывают водой или буферным рабочим раствором для электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия P для удаления неполимеризованного акриламида. При необходимости выравнивают перегородки концентрирующего геля с помощью тупой иглы для подкожных инъекций, прикрепленной к шприцу. Снимают зажимы с одной короткой стороны, осторожно вытягивают трубку и возвращают зажимы на место. Повторяют эти операции с другой короткой стороны. Удаляют трубку со дна геля. Помещают гель в прибор для электрофореза. Верхний и нижний резервуары наполняют буферным раствором для электрофореза. Удаляют все пузырьки, образующиеся на дне геля между двумя стеклянными пластинками. Для этих целей лучше всего использовать изогнутую иглу, прикрепленную к шприцу. Не следует проводить первоначальный электрофорез до нанесения образцов, так как это приведет к нарушению прерывистости буферной системы. Перед нанесением образцов осторожно ополаскивают каждую лунку рабочим раствором для электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия P. Готовят испытуемый и контрольный образцы в рекомендованном буферном растворе для образцов и обрабатывают, как указано в частной фармакопейной статье. Наносят необходимое количество каждого раствора в лунки концентрирующего геля.

Электрофорез проводят в условиях, рекомендованных производителем оборудования. Производители оборудования для ДСН-ПААГ могут предоставлять гели различной площади и толщины. Время проведения электрофореза и показатели ток/напряжение могут варьировать при достижении оптимального разделения. Необходимо удостовериться, что фронт красителя перемещается в разделяющий гель. Когда краситель доходит до нижнего края геля, электрофорез останавливают. Кассету с гелем вынимают из прибора и осторожно разделяют стеклянные пластины. Удаляют прокладки, отрезают и отбрасывают концентрирующий гель и немедленно начинают окрашивание оставшегося геля.