Проверка идентичности

При установлении подлинности олигопептидов путем сравнения спектра испытуемого образца со спектром стандартного образца или с опубликованным стандартным спектром пики в 2 спектрах должны совпадать по положению, интегральной интенсивности и мультиплетности (общая фармакопейная статья 2.1.2.45. Спектрометрия ядерного магнитного резонанса). Характеристические сигналы, уникальные для каждой аминокислоты, должны быть охарактеризованы определенными химическими сдвигами с соответствующими доверительными интервалами, приведенными в частной фармакопейной статье.

При установлении подлинности полипептидов используют одномерные спектры ¹H целиком, как "отпечатки пальца" объекта, без детализации значений химических сдвигов и мультиплетности отдельных сигналов. Рекомендуется проводить сравнение нормированных интегральных интенсивностей характеристичных областей спектров ¹H испытуемого и стандартного образцов, содержащих сигналы определенных аминокислотных функциональных групп. Например, сигналы протонов метильных групп алифатических остатков находятся в интервале 0,9 - 1,5 ppm, области сигналов остальных протонов алифатических боковых цепей - 1,5 - 3,5 ppm, протонов - 3,5 - 4,5 ppm, ароматических протонов, протонов пептидных групп - 6,7 - 9,0 ppm. Характеристическая область протона имидазола в гистидине 8,0 - 9,2 ppm, NH-индольного протона триптофана 9,0 - 11,0 ppm. Области спектра, содержащие сигналы остаточных органических растворителей, не учитывают при проведении нормированного интегрирования. Доверительные интервалы нормированных интегральных интенсивностей характеристичных областей спектров ¹H приводят в частной фармакопейной статье.

Установление подлинности олигопептидов при отсутствии стандартных образцов включает в себя идентификацию аминокислот и определение аминокислотной последовательности в пептидной цепи. Идентификацию аминокислот проводят в 3 этапа:

I. Соотнесение сигналов спектров ¹H и ¹³C к конкретным углеводородным фрагментам (метильным, метиленовым, метиновым, ароматическим группам) на основе данных спектра ¹H - ¹³C HSQC;

II. Определение соседних углеводородных фрагментов, связанных ковалентной связью, и составление последовательности из углеводородных фрагментов на основе данных ¹H - ¹H COSY и при необходимости ¹H - ¹H TOCSY;

III. Объединение в молекулу углеводородных фрагментов (алифатических и ароматических) и амидных групп на основе данных спектра ¹H - ¹³C HMBC.

Аминокислотную последовательность в олигопептиде устанавливают на основе данных спектра ¹H - ¹³C HMBC по наличию кросс-пиков между сигналами групп и C=O групп соседних аминокислот.