МЕТОД 5. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С O-ФТАЛЕВЫМ АЛЬДЕГИДОМ

Предколоночная дериватизация аминокислот с o-фталевым альдегидом (ОФА) проводится перед разделением смеси аминокислот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием. Метод не позволяет определять аминокислоты, являющиеся вторичными аминами (например, пролин).

ОФА в присутствии тиольных соединений реагирует с первичной аминогруппой, образуя производные изоиндола с сильной флуоресценцией. В качестве тиольных соединений могут быть использованы 2-меркаптоэтанол и 3-меркаптопропионовая кислота. ОФА не обладает флуоресценцией и, следовательно, не образует мешающих пиков. Кроме того, его растворимость и стабильность в водном растворе, наряду с высокой скоростью реакции, позволяет проводить автоматическую дериватизацию с использованием автодозатора для смешивания испытуемого образца и реагента. Основным недостатком ОФА является отсутствие у него способности реагировать со вторичными аминокислотами (например, пролином). Компенсировать данный недостаток можно сочетанием с методиками, описанными в методах 7 или 8.

Предколоночная дериватизация аминокислот с ОФА используется для пробоподготовки перед обращенно-фазовой ВЭЖХ. Так как ОФА-производные аминокислот неустойчивы, анализ и разделение методом ВЭЖХ проводят немедленно после дериватизации. Хроматограф для жидкостной хроматографии должен быть оснащен флуометрическим детектором для обнаружения производных аминокислот. Интенсивность флуоресценции ОФА-производных аминокислот измеряют при длине волны возбуждающего света 348 нм и длине волны излучаемого света 450 нм.

Заявленный предел обнаружения при флуориметрическом детектировании не ниже 50 фмоль, однако на практике предел обнаружения составляет 1 пмоль.