МЕТОД 5

Данный метод (обычно называемый биуретовым методом количественного определения) основан на взаимодействии двухвалентного иона меди (Cu²⁺) с белком в щелочной среде, что приводит к появлению максимума поглощения при длине волны 545 нм. Метод обнаруживает минимальное различие между равными количествами иммуноглобулиновых и альбуминовых образцов. Прибавление натрия гидроксида и биуретового реактива в виде комбинированного реактива, недостаточное перемешивание после прибавления натрия гидроксида или продолжительный период времени между прибавлением натрия гидроксида и биуретового реактива завышают значения оптической плотности иммуноглобулиновых образцов по сравнению с альбуминовыми образцами. Метод с трихлоруксусной кислотой, используемый для минимизации влияния мешающих веществ, также может быть применен для определения содержания белка в испытуемых образцах при концентрациях ниже 500 мкг/мл.

Для приготовления всех буферных растворов и реактивов, применяемых в данном методе, используют воду дистиллированную P.

Испытуемый раствор. Готовят раствор испытуемого образца в растворе 9 г/л натрия хлорида P с концентрацией белка в пределах интервала концентраций калибровочной кривой.

Растворы сравнения. Готовят раствор соответствующего стандартного образца белка в растворе 9 г/л натрия хлорида P. Порции полученного раствора разводят раствором 9 г/л натрия хлорида P для получения не менее трех растворов сравнения с концентрациями белка, равномерно распределенными в интервале от 0,5 мг/мл до 10 мг/мл.

Контрольный раствор. Раствор 9 г/л натрия хлорида P.

Биуретовый реактив. 3,46 г меди (II) сульфата P растворяют в 10 мл горячей воды дистиллированной P и охлаждают (раствор А). 34,6 г натрия цитрата P и 20,0 г натрия карбоната безводного P растворяют в 80 мл горячей воды дистиллированной P и охлаждают (Б). Смешивают растворы А и Б и доводят водой дистиллированной P до объема 200 мл. Используют полученный раствор в течение шести месяцев. Реактив нельзя использовать, если он становится мутным или образуется осадок.

Методика. К 1 объему испытуемого раствора прибавляют равный объем раствора 60 г/л натрия гидроксида P и перемешивают. Тотчас добавляют биуретовый реактив в количестве, равном 0,4 объема испытуемого раствора, и быстро перемешивают. Выдерживают при температуре от 15 °C до 25 °C не менее 15 мин. В течение 90 мин после прибавления биуретового реактива измеряют оптические плотности (2.1.2.24) растворов сравнения и испытуемого раствора при длине волны 545 нм, используя контрольный раствор в качестве компенсационного раствора. Мутные растворы или растворы с осадком непригодны для определения концентрации белка.

Расчеты. Зависимость оптической плотности от концентрации белка имеет почти линейный характер в рамках указанного интервала концентрации белка для растворов сравнения. Строят график зависимости оптических плотностей растворов сравнения от концентраций белка и, используя линейную регрессию, строят калибровочную кривую. Рассчитывают коэффициент корреляции для калибровочной кривой. Система считается пригодной, если линейная зависимость имеет коэффициент корреляции не менее 0,99. На основании калибровочной кривой и оптической плотности испытуемого раствора определяют концентрацию белка в испытуемом растворе.

Мешающие вещества. Для минимизации влияния мешающих веществ белок может быть осажден из испытуемого образца следующим образом: к 1 объему раствора испытуемого образца прибавляют 0,1 объема раствора 500 г/л трихлоруксусной кислоты P, удаляют надосадочную жидкость и растворяют осадок в небольшом объеме 0,5 M раствора натрия гидроксида. Полученный раствор используют для приготовления испытуемого раствора.