2.1.3.4. Идентификация пептидов методом спектрометрии ядерного магнитного резонанса (201030004-2022)

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод спектрометрии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для идентификации пептидов.

Подтверждение подлинности пептидов методом ЯМР проводят в соответствии с общей фармакопейной статьей 2.1.2.45. Спектрометрия ядерного магнитного резонанса.

Общие принципы. Установление подлинности пептида осуществляют путем сравнения одномерных спектров испытуемого образца (как правило, ¹H и ¹³C) со спектрами фармакопейного стандартного образца или со спектрами, приведенными в частной фармакопейной статье и (или) в нормативном документе по качеству При отсутствии фармакопейного стандартного образца можно использовать стандартный образец, идентичность которого подтверждают самостоятельной структурной интерпретацией одномерных спектров (применимо к олигопептидам до 20 аминокислотных остатков при естественном содержании изотопов ¹³C). Структурная интерпретация осуществляется с использованием двумерных методов корреляционной спектроскопии - COSY (Correlation Spectroscopy), TOCSY (Total Correlation Spectroscopy), HSQC (Heteronuclear Single-Quantum Correlation Spectroscopy), HMBC (Heteronuclear Multiple-Bond Correlation Spectroscopy). В основе данных методов лежит общий подход переноса намагниченности от одного спина ядра к другому посредством спин-спинового взаимодействия, химического обмена или кросс-релаксации.

Гомоядерная корреляционная спектроскопия (COSY) в различных модификациях используется для идентификации ядер атомов (чаще всего ¹H), разделенных двумя или тремя химическими связями и участвующих в спин-спиновом взаимодействии друг с другом. Полная корреляционная спектроскопия (TOCSY) позволяет регистрировать наличие спин-спинового взаимодействия между однотипными ядрами атомов, которые связаны между собой непрерывной цепочкой взаимодействий. Гетероядерная одноквантовая корреляционная спектроскопия HSQC определяет корреляции между атомными ядрами двух разных типов, которые разделены одной связью (как правило, между протонами и ядрами углерода в определенном углеводородном фрагменте). Гетероядерная многосвязная корреляционная спектроскопия HMBC определяет корреляции между протонами и ядрами X (как правило, ¹³C), разделенными двумя или тремя связями (в редких случаях большим числом связей).

Прибор. Если не предписано иное, используют импульсный ЯМР спектрометр с рабочей частотой не менее 300 МГц.

Методика. При необходимости испытуемый образец подвергают предварительной лиофилизации. Испытуемый образец или его лиофилизат растворяют в дейтерированном растворителе, к которому может быть добавлен соответствующий эталон для калибровки химического сдвига (общая фармакопейная статья 2.1.2.45. Спектрометрия ядерного магнитного резонанса). В качестве дейтерированного растворителя, как правило, используют дейтерированную воду или буферный раствор в дейтерированной воде. Состав буферного раствора, его pH, концентрация пептида приводят в частной фармакопейной статье и (или) в нормативном документе по качеству.

После помещения в магнит образец термостатируют не менее 5 мин. Регистрацию спектров испытуемого и стандартного образцов проводят в идентичных условиях (одинаковые растворитель, концентрация, температура, параметры эксперимента - ширина спектра, время задержки между импульсными последовательностями, число накоплений сигнала спада свободной индукции, количество точек для Фурье-преобразования), которые приводят в частной фармакопейной статье и (или) в нормативном документе по качеству. Ширина спектра должна охватывать полный спектр пептида с пустой спектральной областью с обеих сторон. Обычно подходящей является ширина спектра 12 ppm или 16 ppm.

Регистрацию спектра при температуре, существенно отличающейся от комнатной, проводят в режиме температурной стабилизации. В противном случае проводят оценку влияния эффекта температурных изменений на внешний вид спектра.