Отделение стериновой фракции (ТСХ)

Получают неомыляемые вещества жирного масла и затем отделяют стериновую фракцию методом тонкослойной хроматографии (2.1.2.26), используя ТСХ пластинку со слоем силикагеля P толщиной от 0,2 мм до 0,5 мм.

Испытуемый раствор (а). В колбу вместимостью 150 мл, снабженную обратным холодильником, помещают объем 2 г/л раствора бетулина P в метиленхлориде P, соответствующего около 10% бетулина от содержания стерина в образце, взятом для определения (например, в случае оливкового масла прибавляют 500 мкл, в случае других растительных масел - 1500 мкл раствора бетулина). При наличии в частной фармакопейной статье указания на определение процентного содержания стеринов в стериновой фракции, то раствор бетулина допускается не прибавлять. Упаривают досуха в токе азота P, прибавляют 5,00 г (m) испытуемого образца, добавляют 50 мл 2 M калия гидроксида спиртового раствора P и нагревают на водяной бане в течение 1 ч, часто перемешивая содержимое колбы круговыми движениями. Охлаждают до температуры ниже 25 °C и с помощью 100 мл воды P количественно переносят содержимое колбы в делительную воронку. Осторожно встряхивают с тремя порциями эфира, свободного от пероксидов, P по 100 мл. Объединенные эфирные слои помещают в другую делительную воронку, содержащую 40 мл воды P, осторожно встряхивают в течение нескольких минут, выдерживают до расслоения и отбрасывают водный слой. Эфирный слой промывают несколькими порциями воды P по 40 мл до тех пор, пока водный слой не перестанет давать щелочную реакцию по фенолфталеину. Эфирный слой переносят в предварительно взвешенную колбу, промывая делительную воронку эфиром, свободным от пероксидов, P. Эфир отгоняют с необходимыми предосторожностями и прибавляют к остатку 6 мл ацетона P. Осторожно удаляют растворитель в токе азота P, остаток сушат до постоянной массы при температуре от 100 °C до 105 °C, охлаждают в эксикаторе и взвешивают. Остаток переносят в небольшую пробирку с помощью метиленхлорида P. Упаривают в токе азота до объема около 1 мл. В зависимости от неомыляемого содержимого масла концентрацию раствора доводят до (25 - 50) мг/мл.

Испытуемый раствор (б). 5,00 г рапсового масла P обрабатывают в соответствии с указаниями для испытуемого образца, начиная со слов "добавляют 50 мл 2 M калия гидроксида раствора спиртового P".

Испытуемый раствор (в). 5,00 г подсолнечного масла P обрабатывают в соответствии с указаниями для испытуемого образца, начиная со слов "добавляют 50 мл 2 M калия гидроксида раствора спиртового P".

Раствор сравнения. 25 мг холестерина P и 10 мг бетулина P растворяют в 1 мл метиленхлорида P.

Для каждого испытуемого образца используют отдельную пластинку.

Условия хроматографирования:

- ТСХ пластинка со слоем силикагеля G P;

- подвижная фаза: эфир P - гексан P (35:65, об/об);

- объем наносимый пробы: 10 мкл раствора сравнения (на расстоянии 20 мм от основания и 10 мм от левого края в виде полоски размером 10 мм);

- по 0,5 мл испытуемых растворов (а), (б), или (в) (на расстоянии 20 мм от основания в виде полоски размером 150 мм);

- пробег фронта подвижной фазы: 17 см от линии старта;

- высушивание: в токе азота P;

- детектирование: в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм после опрыскивания раствором 2 г/л дихлорфлуоресцеина P в этаноле безводном P.

На хроматограмме раствора сравнения обнаруживаются полосы, соответствующие холестерину и бетулину. На хроматограммах испытуемых образцов обнаруживаются полосы со значениями R_F, соответствующим стеринам.

С хроматограммы каждого испытуемого раствора снимают слой силикагеля с полосами стеринов, а также дополнительно силикагель на (2 - 3) мм выше и ниже видимых зон, соответствующих раствору сравнения, и помещают раздельно в три колбы вместимостью по 50 мл. В каждую колбу прибавляют по 15 мл метиленхлорида P и нагревают в течение 15 мин с обратным холодильником при перемешивании. Каждый раствор пропускают через стеклянный фильтр (40) (2.1.1.2) или подходящую фильтровальную бумагу и промывают каждый фильтр тремя порциями метиленхлорида P по 15 мл. Каждый из трех объединенных фильтратов и смывов помещают в три колбы, упаривают в токе азота P до объема от 5 мл до 10 мл. Переносят содержимое каждой колбы в небольшие пробирки и упаривают в токе азота P досуха.

Требование:

- на хроматограмме раствора сравнения обнаруживаются полосы, соответствующие холестерину и бетулину;

- на хроматограммах испытуемых растворов обнаруживаются полосы со значениями R_F, соответствующим стеринам.