МЕТОД 7

Восстановление и алкилирование цистеина/цистина происходит при пиридилэтилировании в паровой фазе.

Восстанавливающий раствор. 83,3 мкл пиридина, 16,7 мкл 4-винилпиридина, 16,7 мкл трибутилфосфина и 83,3 мкл воды помещают в подходящий контейнер и перемешивают.

Методика. Ампулу для гидролиза с образцом белка/пептида (от 1 мкг до 100 мкг) помещают в большую ампулу. Переносят восстанавливающий раствор в большую ампулу, герметично запаивают в вакууме (около 50 мкм ртутного столба, или 6,7 Па) и нагревают при температуре около 100 °C в течение 5 мин. Затем внутреннюю ампулу для гидролиза помещают в вакуумный эксикатор и сушат в течение 15 мин для удаления остатков реактивов. Пиридилэтилированный образец затем гидролизуют согласно описанной ранее методике. Для оценки открываемости пиридилэтилцистеина параллельно проводят реакцию пиридилэтилирования стандартного образца белка, содержащего 1 - 8 остатков цистеина. Длительное время инкубации при реакции пиридилэтилирования может быть причиной модификации концевых и лизина в белке.